改进HPLC法测定注射用丹参多酚酸盐中丹酚酸B的含量Δ

吴 妍，耿魁魁，邓晓媚，马旖旎，陈 辰，刘 圣（安徽省立医院药剂科，合肥 230001）

改进HPLC法测定注射用丹参多酚酸盐中丹酚酸B的含量Δ

吴 妍＊，耿魁魁，邓晓媚，马旖旎，陈 辰，刘 圣#（安徽省立医院药剂科，合肥 230001）

目的：改进注射用丹参多酚酸盐中丹酚酸B含量的测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Hypersil ODS C18，流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59，V/V/V/V），流速为1.0 ml/min，检测波长为286 nm，柱温为25Ⅱ，进样量为10 μl。结果：丹酚酸B检测质量浓度线性范围为0.1～3.2 mg/ml（r＝0.999 6）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率为98.15%～100.23%（RSD＝0.58%，n＝9）。结论：改进的方法灵敏度更高、重复性更好，适用于测定注射用丹参多酚酸盐中丹酚酸B的含量。

高效液相色谱法；注射用丹参多酚酸盐；丹酚酸B；含量测定

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎[1]，注射用丹参多酚酸盐是由丹参提取的以丹酚酸B为主要活性成分的水溶性化合物[2-4]。该化合物有活血、化瘀、通脉的功效，可用于冠心病稳定型心绞痛症见胸痛、胸闷、心悸者。目前，对丹参多酚酸盐、丹参药材及其制剂中相关成分的研究较多，且方法均较复杂[5-7]。因此，本课题组在前期正交试验的基础上[8]，改进了流动相，建立了以高效液相色谱法（HPLC）测定注射用丹参多酚酸盐中丹酚酸B含量的方法，以期为注射用丹参多酚酸盐的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-2010A HT型HPLC仪，包括紫外检测器、四元低压泵、自动进样器、LabSolutions Version 5.51色谱工作站（日本Shimadzu公司）；PHS-3C型电子pH计（上海雷磁仪器厂）；FA2004B型万分之一电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；KJ-202型振荡器（江苏康健医疗用品有限公司）；TGL-16B型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 药品与试剂

注射用丹参多酚酸盐（上海绿谷制药有限公司，批号：1507132、1603091，规格：100 mg/支）；0.9%氯化钠注射液（安徽丰原药业股份有限公司，批号：14072395，规格：250 ml/袋）；丹酚酸B对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：115939-25-8，纯度≥98%）；甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯，水为灭菌注射用水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59，V/V/V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：286 nm；柱温：25Ⅱ；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取丹酚酸B对照品适量，置于1.5 ml离心管中，加75%甲醇溶液1.0 ml，以1 000 r/min振荡4 min后，以半径为5.9 cm、转速为1 000 r/min离心1 min，即得质量浓度为32 mg/ml的对照品贮备液。精密吸取上述贮备液100 μl，置于1.5 ml离心管中，加75%甲醇溶液溶解并稀释至1.0 ml，混匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取样品100 mg，置于125 ml量瓶中，加0.9%氯化钠注射液溶解并定容，摇匀，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取0.9%氯化钠注射液作为阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密吸取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。在此色谱条件下，丹酚酸B与其他成分分离较好，理论板数按丹酚酸B峰计≥2 000，且阴性对照在对照品主峰相应的保留时间处（7.48 min）无色谱峰出现，表明对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.丹酚酸BFig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.salvianolic acid B

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 ml，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，mg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得丹酚酸B的回归方程为y＝7 202 620x+30 990（r＝0.999 6）。结果表明，丹酚酸B检测质量浓度线性范围为0.1～3.2 mg/ml。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，丹酚酸B峰面积的RSD＝0.91%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：1507132）适量，分别于室温下放置0、1、2、4、6、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，丹酚酸B峰面积的RSD＝0.42%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置8 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批样品（批号：1507132）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，丹酚酸B的平均含量为78%，RSD＝1.35%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：1507132）10 mg，精密称定，共9份，各置于10 ml量瓶中，分别加入低、中、高质量的丹酚酸B对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取2批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算丹酚酸B的含量。结果，2批样品（批号：1507132、1603091）中丹酚酸B的平均含量分别为77.73%、79.21%，RSD分别为1.33%、1.43%（n＝3）。

3 讨论

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

3.1 流动相的选择

本课题组在预试验时分别采用甲醇-5 mmol/L磷酸二氢钾[9]、乙腈-0.03%磷酸[10]、甲醇-乙腈-水为流动相。结果，前两种溶液作为流动相时丹酚酸B峰存在拖尾现象，理论板数较低，且保留时间相对较短；而甲醇-乙腈-水作为流动相时丹酚酸B峰稍有拖尾。笔者在后者基础上进行改进，加入甲酸，结果丹酚酸B峰形改善。因此，本试验最终选择甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59，V/V/V/V）作为流动相。

3.2 对含量测定结果的分析

丹酚酸B又称丹酚乙酸（Salianic acid B）[10]，按照注射用丹参多酚酸盐的质量标准（YBZ09012005-2010Z-2013）丹参乙酸镁含量应达80.0%～90.0%，因丹参乙酸镁为丹酚酸B的镁盐存在形式，且丹参乙酸镁含量＝丹酚酸B含量×1.03[3]，故注射用丹参多酚酸盐中丹酚酸B含量应达到77.67%～87.38%。从本研究结果来看，各批次样品中丹酚酸B含量的检测结果均符合质量标准，但含量还是相对较低。

综上所述，改进的方法灵敏度更高、重复性更好，适用于测定注射用丹参多酚酸盐中丹酚酸B的含量。

[1] 高元峰，陈虎，王银辉，等.丹酚酸B对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药房，2013，24（43）：4 047.

[2] 赵业清，朱慧娟，文九芳.丹参多酚酸盐注射液治疗冠心病心绞痛的系统评价[J].现代中西医结合杂志，2012，21（16）：1 722.

[3] 赵琼，任大伟，杨瑞花，等.丹参不同产地加工方法对丹参多酚酸盐质量的影响[J].中华中医药杂志，2013，28（3）：645.

[4] 吴笛，叶秋雄，李楚源.一测多评法测定复方丹参片中5种酚酸类成分的含量[J].中国新药杂志，2013，22（18）：2 130.

[5] 李安平，杨锡，丁永辉，等.HPLC法同时测定丹参注射液中8种成分[J].兰州大学学报：医学版，2012，38（3）：34.

[6] 薛静，叶正良，李德坤，等.HPLC同时测定丹参多酚酸中丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（3）：70.

[7] 厉瑶，郭正泰，龚行楚，等.丹参红花混煎液中丹参素、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的HPLC测定方法[J].中国中药杂志，2013，38（11）：1 653.

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Content Determination of SalvianolicAcid B in Salvianolate Injection by Improved HPLC

WU Yan，GENG Kuikui，DENG Xiaomei，MA Yini，CHEN Chen，LIU Sheng（Dept.of Pharmacy，Anhui Provincial Hospital，Hefei 230001，China）

OBJECTIVE：To improve the method of content determination of salvianolic acid B in Salvianolate injection. METHODS：HPLC method performed on the column of Hypersil ODS C18with mobile phase of methanol-acetonitrile-methanoic acid-water（30∶10∶1∶59，V/V/V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 286 nm，column temperature was 25Ⅱ，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range of salvianolic acid B was 0.1-3.2 mg/ml（r＝0.999 6）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recovery was 98.15%-100.23%（RSD＝0.58%，n＝9）.CONCLUSIONS：The improved method is more sensitive and reproducible，and suitable for the content determination of salvianolic acid B in Salvianolate injection.

HPLC；Salvianolate injection；Salvianolic acid B；Content determination

R917

A

1001-0408（2016）36-5135-03

2016-01-15

2016-08-19）

（编辑：刘 柳）

安徽省卫生计生委中医药科研课题（No.2014zy20）

＊主管药师。研究方向：临床药学。电话：0551-62284181。E-mail：aydwy@126.com

#通信作者：主任中药师。研究方向：临床药学与药剂学。电话：0551-62284029。E-mail：lslcclhl@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.30