血液乙肝病毒基因检测

郭松梅

(虎林市中心血库, 黑龙江　虎林　158499)



血液乙肝病毒基因检测

郭松梅

(虎林市中心血库, 黑龙江虎林158499)

全世界每年死于乙型肝炎病毒相关疾病的人数已达60万人，应用荧光定量PCR法检测能够提高乙肝病毒基因的检出率，正确掌握该技术方法能够更加有效地进行疾病诊断和预防工作。基于此，研究针对荧光定量PCR法检测乙肝病毒基因的方法进行探讨。

乙肝病毒；荧光定量PCR；检测

乙型肝炎病毒简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，这是一种传染性很强的病毒，它可以通过血液、精液和其他体液进行传播。基于8%个核苷酸序列的基因型之间的差异，乙型肝炎病毒已被分为10个基因型，从A到J[1]。全世界每年死于乙型肝炎病毒相关疾病至少有60万人，如慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌[2]。因此，该疾病的检测与预防显得尤为重要。乙肝病毒基因检查的实验室诊断主要依赖于血清特异性抗原抗体检测和乙肝病毒基因检测。酶联免疫方法一直是临床诊断乙肝病毒感染的传统手段；而乙肝病毒基因检测则是采用聚合酶链反应技术，能够提高乙肝病毒基因的检出率，为临床诊断是否为乙肝病毒感染提供了一种强有力的手段。鉴于此，以下针对该技术方法进行深入探讨。

1　样品与材料

1.1临床样本来源

将收集到的乙型肝炎病毒 HBsAg阳性患者全血样本及时处置。采血管3 000 r/min离心10 min后，无菌操作条件下分离血浆和血细胞。

1.2药品和仪器

乙肝病毒血清标志物ELISA检测试剂盒、乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒、Thermo -80 ℃ 冰箱、移液器、高速低温离心机、荧光定量PCR仪、电泳仪、酶标仪、电热恒温水浴锅、超净台、电热恒温水浴锅、微波炉。

2　实验方法

2.1血清标志物检测

应用乙肝病毒血清标志物ELISA检测试剂盒，采用酶联免疫法对乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)、乙肝表面抗体(抗-HBs)、乙肝e抗体(抗-HBe)和乙肝核心抗体(抗-HBc)进行检测。

2.2DNA 定量检测

应用乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒，采用荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA。

2.3基因组DNA提取

将200 μL待测血清、20 μL QIAGEN蛋白酶K，200 μL Buffer AL加入1.5 mL Eppendorf管中；混匀振荡15 s。56 ℃ 温育10 min。离心后加入200 μL无水乙醇，混匀振荡15 s。将上述溶液全部转至离心柱中，8 000 r/min 离心1 min，弃去废液和离心管，换为新的离心管；向离心柱中加入500 μL Buffer AW1，8 000 r/min离心1 min，弃去废液和离心管，换为新的离心管；向离心柱中加入500 μL buffer AW2，14 000 r/min 离心3 min，弃去废液和离心管；将离心柱置于1.5 mL无菌EP管中，加入60 μL去离子水，室温静置1 min后，8 000 r/min 离心1 min。将收集到的DNA于-40 ℃保存待用。

2.4基因扩增

引物设计完成后，设置基因组各基因片段PCR反应条件如预变性、变性、退火、延伸、循环数、结束条件以及相应参数进行基因扩增。

2.5PCR产物鉴定

取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶，通过凝胶成像仪下观察各扩增产物的条带有无及大小，若扩增片段大小与目的基因一致则扩增成功。

2.6序列测定

将PCR扩增成功的产物经克隆后进行测序。

3　结　果

对送检的血清标本进行DNA荧光定量PCR测定，其HVB DNA阳性者均能准确检测。

4　总　结

JACK等最近的研究表明,建立引物组可以提高乙肝病毒基因组检测分析的灵敏度[2]。ROSA等[3]调查发现，在过去的五年中，低收入国家的乙型肝炎病毒(HBV)感染呈中度或高度的流行程度。由于乙型肝炎病毒的普遍接种方案开始于九十年代，急性乙型肝炎和乙型肝炎表面抗原慢性携带者的患病率已降低。然而一些国家，仍无法实施这些方案，特别是在农村地区的发病率较高。乙肝病毒感染的扩散在少数低收入国家仍然很广泛，预防、管理和治疗乙肝病毒感染是政府和医疗机构的沉重负担[3]。因此广泛推广乙肝病毒检测技术显得尤为迫切，同时需要配合乙型肝炎病毒的预防接种工作[4-5]。

[1]JACK B C, WOON L T,YUN F N,et al.Universal primers for detection and sequencing of hepatitis B virus genomes across genotypes A to G[J]. J Clin Microbiol，2015，53(6): 1831-1835.

[2]MUSTAFA S. Hepatitis B virus genotypes: Global distribution and clinical importance[J]. World J Gastroenterol，2014，20(18): 5427-5434.

[3]ROSA Z, AORIANA B, CATERINA S, et al.Hepatitis B virus burden in developing countries[J]. World J Gastroenterol， 2015，21(42): 11941-11953.

[4]YURI C, MARTIN R, EIKE R.Hepatitis B virus large surface protein: function and fame[J]. Hepatobiliary Surg Nutr， 2015，4(1): 1-10.

[5]JASON L, LAURA F S, MICHAEL J B.Hepatitis B virus and microRNAs: Complex interactions affecting hepatitis B virus replication and hepatitis B virus-associated diseases[J]. World J Gastroenterol，2015，21(24): 7375-7399.

Detection of Hepatitis B virus Gene in Blood

GUO Songmei

(Hulin Central Blood Bank, Heilongjiang Hulin 158499, China)

At least 600 000 individuals worldwide annually die of hepatitis B virus (HBV)-related diseases.The detection rate of hepatitis B virus gene could be improved by using fluorescence quantitative PCR method, and correctly grasp the technical method can be more effective in disease diagnosis and prevention. Based on this, this study aimed to explore the method of detection of hepatitis B virus gene by fluorescence quantitative PCR method.

hepatitis B virus; fluorescence quantitative PCR; detection

1006-446X(2016)08-0068-03

2016 - 03 - 23

郭松梅(1975—)，女，副主任检验技师，学士，主要从事输血及病毒检测研究。

R 512.62

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