武当山区栽培重楼根茎与须根中九种重楼皂苷含量比较

吴建平，叶方，陈黎，胡培，朱敏，孙良学，雷攀

(1.湖北医药学院附属十堰市太和医院药学部，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院药学院，湖北 十堰 442000；3.湖北济世药业有限责任公司，湖北 十堰 442000)

·论 著·

武当山区栽培重楼根茎与须根中九种重楼皂苷含量比较

吴建平1，2，叶方1，2，陈黎1，2，胡培2，朱敏2，孙良学3，雷攀1，2

(1.湖北医药学院附属十堰市太和医院药学部，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院药学院，湖北 十堰 442000；3.湖北济世药业有限责任公司，湖北 十堰 442000)

目的 比较武当山区栽培重楼根茎与须根中九种重楼皂苷含量，考察皂苷类次生代谢产物在重楼不同生长部位的分布情况，为重楼药材综合开发利用、节约资源提供参考。方法采集武当山区种植基地里重楼药材样本，采用高效液相色谱法测定各个样本中九种重楼皂苷的含量。结果七叶一枝花(华重楼)和云南重楼(滇重楼)中皂苷成分在根茎与须根中均有分布。多叶重楼、长药隔重楼、狭叶重楼、宽叶重楼等须根中含有部分皂苷成分，但根茎中皂苷含量非常低。结论重楼须根与重楼根茎有一定的化学等同性，建议重楼须根作为中成药原料使用。

重楼；重楼皂苷；根茎；须根；高效液相色谱法

重楼是常用中药，始载于《神农本草经》，称“蚤休”，列为下品[1]。我国境内重楼分布有7种8变种[2]，武当山区分布有2种6变种[3]，当地统称“七叶一枝花”或“海螺七”，除《中国药典》[4]2015版收载的云南重楼(滇重楼)[Paris polyphylla Smith var.yunnanensis (Franch.)Hand.-Mazz.]或七叶一枝花(华重楼)[Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara.]外，药农在采集过程中将其他品种均作为药用重楼采挖。根据药典规定，重楼药材炮制时要去除须根，而随着中药材资源日趋减少，除积极开展人工种植外，开发法定品种的替代品种或者替代药用部位也是重要手段。课题组与当地中药种植企业合作在当地开展重楼的人工种植，采集重楼样本，测定重楼皂苷类成分，研究不同部位是否具有化学成分等同性，探讨重楼须根作为药用的可能性，为重楼药材的综合开发利用提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 戴安UltiMateTM3000型HPLC仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chromeleon软件数据处理系统(美国戴安公司)；JJ200型精密电子天平(美国双杰兄弟集团有限公司常熟双杰测试仪器厂)；FA-2004型电子分析天平(上海精科天平)；AUW-120D型电子分析天平(日本岛津)。科盟牌超声清洗机(广州市科洁盟实验仪器有限公司，240 W，40 kHz)；顶帅DS-T100A型高速多功能粉碎机(上海市顶帅工贸有限公司，29 000 r/min，1 000 W)；H.H.S11-2型电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂，500 W)。

1.2 试药 重楼皂苷Ⅰ(批号：111590-201103，含量92.1%)、重楼皂苷Ⅱ(批号：111591-201103，含量93.4%)、薯蓣皂苷(重楼皂苷Ⅲ，批号：111707-201402，含量96.2%)、重楼皂苷Ⅵ(批号：111592-201203，含量95.1%)、重楼皂苷Ⅶ(批号：111593-201303，含量92.5%)等对照品均购自中国食品药品检定研究院；纤细薯蓣皂苷(批号：141125，含量98%)、重楼皂苷D(批号：141105，含量98%)、重楼皂苷V(批号：150716，含量98%)、重楼皂苷H(批号：150714，含量98%)均购自成都普菲德生物技术有限公司。重楼药材样品采自十堰市茅箭区马家河龙王寨重楼种植基地(见表1)。样品打粉，过三号筛备用；甲醇、乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，其他试剂为分析纯。

表1 样品基源及采集日期

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Atlantis®T3(3μm，150 mm×4.6 mm)，预柱(10 mm×4.6 mm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱(见表2)。流速0.8 mL/min，检测波长203 nm，柱温30℃，进样量10 μL。

表2 流动相梯度洗脱程序表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷D、重楼皂苷V、重楼皂苷Ⅲ、纤细薯蓣皂苷(X)对照品适量，分别配成4.992 mg/mL、4.900 mg/mL、5.200 mg/mL、5.172 mg/mL、4.812 mg/mL、4.780 mg/mL、5.172 mg/mL、5.072 mg/mL、4.852 mg/mL对照品贮备液。取9种对照品贮备液各1 mL稀释至10 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取上述重楼药材粗粉0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25 mL，称定重量，水浴加热回流30 min，放冷后再称定，用乙醇补足减失的重量，摇匀，以0.45 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 线性关系考察 精密移取混合对照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL分别置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。分别取10 μL进样，在上述色谱条件下进行分析。以对照品进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得到九种皂苷的回归方程。结果重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷的回归方程分别为：yⅠ=6.688 3x+0.474 9(r2= 0.999 4)，yⅡ=6.103 9x-0.155 2(r2=0.999 7)，yⅢ=6.626 2x+ 0.027(r2=0.999 7)，yD=7.258 7x+0.086 9(r2=0.999 8)，yV= 8.423 4x+0.522 6(r2=0.999 6)，yⅥ=7.886 1x+0.062 8 (r2=1.000 0)，yⅦ=5.959 5x+0.009 9(r2=0.999 8)，yH= 6.751 2x+0.131(r2=0.999 8)，yX=7.150 7x+0.349 3(r2= 0.999 6)。表明重楼皂苷Ⅰ在0.099 8～4.992 0 μg、重楼皂苷Ⅱ在0.098 0～4.900 0 μg、重楼皂苷Ⅲ在0.104 0～5.200 0 μg、重楼皂苷D在0.103 4～5.172 0 μg、重楼皂苷V在0.096 2～4.812 0 μg、重楼皂苷Ⅵ在0.095 6～4.780 0 μg、重楼皂苷Ⅶ在0.103 4～5.172 0 μg、重楼皂苷H在0.101 4～5.072 0 μg、纤细薯蓣皂苷在0.097 0～4.85 μg范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验 取混合对照品溶液10 μL自动进样，重复6次，测定峰面积，结果重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷的RSD分别为0.83%、1.05%、1.27%、1.79%、1.25%、1.09%、1.08%、1.83%、1.65%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于0、2 h、5 h、10 h、15 h、24 h进样，每次10 μL，测定峰面积，计算重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H、纤细薯蓣皂苷的RSD分别为1.41%、1.63%、1.71%、1.83%、1.90%、1.52%、1.79%、1.29%、1.85%，n=6，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 取同一样品5份，按“2.2.2”项下方法平行操作，按“2.1”色谱条件下测定含量。结果重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H和纤细薯蓣皂苷的含量分别为0.390 3、0.154 8、0.722 0、0.741 4、0.075 7、0.916 5、0.316 0、0.107 1、0.373 9%，RSD分别为1.41%、1.33%、1.72%、1.84%、1.08%、1.52%、0.79%、1.59%、1.43%，表明方法重现性良好。

2.7 加样回收试验 精密称取重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H及纤细薯蓣皂苷适量，然后分别配成0.199 7 mg/mL、0.196 0 mg/mL、0.208 0 mg/mL、0.206 9 mg/mL、0.192 5 mg/mL、0.191 2 mg/mL以及0.206 9 mg/mL、0.202 9 mg/mL、0.1941mg/mL的对照品溶液。精密称取已知含量的14号重楼样品6份，每份0.25 g，精密加入重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、D、Ⅵ、Ⅶ对照品溶液5 mL、2 mL、8 mL、4 mL、8 mL进行加样回收试验；精密称取已知含量的11号样品6份，每份0.25 g，精密加入重楼皂苷Ⅲ、V、H、纤细薯蓣皂苷5 mL、3 mL、1 mL、5 mL进行加样回收率试验，测定含量并计算回收率，见表3。

表3 重楼皂苷加样回收率实验(n=6)

2.8 样品含量测定 取“2.2.2”项下供试品溶液在“2.1”项色谱条件下测定并计算样品中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H和纤细薯蓣皂苷的含量，对照品和样品色谱图见图1，各样品中皂苷含量见表4。

表4 野生转家种重楼药材中九种皂苷成分含量（%）

图1 重楼皂苷的HPLC图

3 讨 论

3.1 不同品种重楼根茎和须根中皂苷含量分布有差异 对武当山区种植基地栽培的几个重楼品种根茎和须根中皂苷含量的分析表明，七叶一枝花(华重楼)和云南重楼(滇重楼)中皂苷成分在根茎与须根中均有分布。滇重楼的根茎和须根中皂苷种类比较相近，主要是重楼皂苷Ⅶ、H等偏诺皂苷类成分含量较高，薯蓣皂苷类成分如重楼皂苷V等也有少量分布；华重楼的根茎和须根中成分分布不同，根茎中主要分布的是薯蓣皂苷类成分，包括重楼皂苷Ⅰ、Ⅲ、V、纤细薯蓣皂苷类成分；须根中主要是重楼皂苷Ⅶ、H等偏诺皂苷类成分；其他品种包括多叶重楼、长药隔重楼、狭叶重楼、宽叶重楼等根茎中皂苷含量非常低，而须根中含有一定的皂苷成分，主要是重楼皂苷Ⅶ、H等偏诺皂苷类等。重楼皂苷是重楼中的主要活性成分[5]，中国药典规定重楼的炮制方法时要求除去须根，但分析结果显示须根中含有较高量的皂苷成分，所以建议在使用时保留须根，特别是用作工业原料时侯。

3.2 不同采收季节重楼中皂苷含量会发生变化 从分析结果看，华重楼和滇重楼秋季采收的样本根茎中皂苷含量高于春季采收的样本，但各个不同品种重楼须根中皂苷含量春季采收时高于秋季。前期研究认为，重楼皂苷有可能在须根中合成后转移至根茎中贮存[6]，课题组在2015年4月至9月连续采集宽叶重楼根茎和须根进行分析，但结果宽叶重楼根茎中皂苷含量非常低，无法进行二者之间的相关性分析，课题组将于后期工作中采集华重楼和滇重楼样本进行考察。

3.3 多种成分分析更能反映中药的整体性特征 中医药的优势是具有整体性及多成份、多靶点的特征[7]，《中国药典》[4]规定采用重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量作为重楼药材质量控制指标，为了更好地分析重楼中有效成分分布规律，测定9种皂苷类成分比较种植基地不同品种、不同部位分布情况，可以更好地帮助企业推广规范化种植，既有良好的经济效益，也有明显的社会效益。

[1]黄奭辑(清).神农本草经[M].北京:中医古籍出版社,1982:298.

[2]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1978:86-96.

[3]叶方,胡培,杨光义,等.湖北武当山地区重楼资源调查[J].中药材, 2015,38(8):1616-1618.

[4]国家药典委员会.中国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2015: 260.

[5]武珊珊,高文远,段宏泉,等.重楼化学成分和药理作用研究进展[J].中草药,2004,35(3):344-347.

[6]叶方,胡培,杨光义,等.重楼根茎与须根中四种重楼皂苷含量比较[J].中国药师,2015,18(12):2073-2075,2122.

[7]杨光义,叶方,郝新才.半仿生提取法在中药新药研究中的应用[J].中国药师,2010,13(8):1188-1190.

Comparative study on nine polyphyllins content in rhizome and fibril of Paris polyphylla in Wudang Mountain.

WU Jian-ping1,2,YE Fang1,2,CHEN Li1,2,HU Pei2,ZHU Min2,SUN Liang-xue3,LEI Pan1,2.1.Department of Pharmacy, Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA;2.School of Pharmacy,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA;3.Hubei Jishi Pharmaceutical Co.,Ltd,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the distribution of nine polyphyllins in different parts of Paris polyphyllaby comparing the contents of relative constituents in Paris polyphylla rhizome and fibril in Wudang Mountain,and to provide reference for comprehensive exploitation and saving Paris polyphylla resources.MethodsParis polyphylla samples were collected from planting base in Wudang mountain area.The high performance liquid chromatography(HPLC) method was used to determine the contents of nine polyphyllins.ResultsPolyphyllins were distributed in both of rhizome and fibril in Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara and Paris polyphylla Smith var.yunnanensis (Franch.)Hara-Mazz.There were some polyphyllins distributed in the fibril of Paris polyphylla,Paris polyphylla Sm.var. thibetica,Paris polyphylla Sm.var.stenophylla,Paris polyphylla var.latifolia,and the polyphyllins content was higher than that in the rhizome.ConclusionParis polyphylla have a certain chemical equivalence between rhizome and fibril, and the fibril of Paris polyphylla was suggested to be used as raw materials of proprietary Chinese medicine.

Paris polyphylla;Polyphyllins;Rhizome;Fibril;High performance liquid chromatography(HPLC)

R280.5

A

1003—6350（2016）22—3613—05

2016-07-02)

湖北省2011计划(编号：4)；2014年湖北省中青年创新团队项目(编号：T201414)；湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心项目(编号：GC2015204)

陈黎。E-mail：chenli0201@sina.com