彗星实验技术在不同细胞DNA损伤检测中的应用

陈果 李晔

摘要：文章对彗星实验在不同真核生物细胞DNA损伤中的应用进行了总结，并介绍了基于彗星实验对植物、动物、人体细胞损伤的研究成果，同时也对彗星实验的应用范围、发展趋势和前景做出了展望。

关键词：彗星实验技术；DNA损伤；真核细胞；损伤检测；遗传毒理问题 文献标识码：A

中图分类号：Q523 文章编号：1009-2374（2016）06-0055-03 DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.06.028

随着经济的快速发展、城市化进程加快，环境问题成为人们日益关注的热点问题。工业三废、电离辐射、化学农药等有毒有害物质对生物界造成了极大的危害，它们不但影响生物的生命活动，而且会影响下一代的遗传性状。因此，研究DNA损伤等遗传毒理问题对于环境安全评价具有重要的意义。

目前，DNA损伤的检测方法可以分为间接检测DNA损伤和直接检测DNA损伤。彗星实验是直接检测DNA损伤的一种方法，也称单细胞凝胶电泳，1984年由Ostling建立，经Singh等改进。该检测方法具有灵敏度高、所需样品量少、应用范围广、材料消耗少、技术简单、时间短、可进行单细胞水平的原位检测等特点，被广泛地应用于真核细胞的DNA损伤与修复、遗传毒理、环境监测以及氧化应激和细胞凋亡等相关研究中。

目前关于彗星实验技术的应用进展大多从其应用领域、范围着手，一定意义上限制了彗星实验在细胞层面上的科学意义以及更宽泛的应用前景。文章从细胞角度切入，归纳总结近些年真核细胞作为彗星实验在应用发展过程中所存在的问题，并就其发展提出发展畅想。

1 彗星实验

彗星实验原理是细胞经过实验中裂解、DNA解链等过程后，电泳时损伤的DNA从核中溢出，朝阳极方向泳动，产生一个尾状带，未损伤的DNA部分保持球形，二者共同形成“彗星”。在一定范围内，“彗星”的长度（代表DNA迁移距离）和经荧光染色后“彗星”荧光强度与DNA损伤程度相关，这样就可以定量检测单个细胞中的DNA损伤。通常实验经过四个步骤：裂解、解旋、电泳及染色、镜检和图像分析。

1.1 裂解

裂解细胞的目的是破膜、去蛋白，以便使断裂的DNA片段能够在外电场作用下从细胞核中迁移出来。去除细胞内蛋白主要有两种方法高盐盐析和蛋白消化。

1.2 解旋

解旋是为了能够降解对实验干扰的RNA，将双链DNA变成单链。通常采用pH大于13的碱性解旋液。这是因为高碱能够降解RNA，同时又会让DNA氢键断裂解螺旋，变成单链。

1.3 电泳及染色

通常根据实验要求设定场强0.5～14V/cm，室温下进行电泳。要求灵敏度时必须在可控温条件下进行。通常采用溴化乙锭（EB）染色。但有研究发现YOYO-1比EB有更高的荧光强度。

1.4 镜检和图像分析

显微镜可直接观察到彗星实验的结果，分析通常采用商业软件，较出名的有Komet，由Kinetic公司开发。

2 彗星实验对不同真核细胞DNA损伤检测应用

理论上，几乎所有的真核细胞发生的DNA损伤都可以用彗星实验来检验，包括人工培养的细胞株或者从动物组织分离出来的细胞，都可在离体或活体染毒后进行彗星实验，但实际应用中受到很多限制。

2.1 对动物细胞DNA损伤检测

动物细胞DNA损伤检测的应用多集中在对动物血液、淋巴和骨髓细胞、肝肾等脏器细胞、生殖细胞等方面DNA损伤的检测。

2.1.1 动物血液和骨髓、淋巴细胞DNA损伤检测。对实验动物血液、骨髓、淋巴细胞DNA损伤检测实验在近些年被广泛应用到新药评价、生物医药学、环境遗传物质检测、环境检测、生物监测以及海洋毒性物质检测等各个领域中来，并且也进行了实验条件的改造和

优化。

Clements et al用五种除草剂在烧杯中对牛蛙的蝌蚪进行直接暴露实验，收集红细胞立即进行彗星实验，结果显示所有的除草剂均能引起彗星尾巴的增多。王军霞等人研究了甲苯和甲醛联合吸入染毒方式对小鼠骨髓细胞的遗传毒性作用，结果显示甲醛和甲苯这两种物质对骨髓细胞彗星尾部DNA含量、彗星细胞尾距形成均有

影响。

2.1.2 动物脏器细胞DNA损伤检测。彗星实验在动物DNA损伤检测中应用最多的集中在脏器损伤检测。可用于彗星实验的生物组织多种多样，比如无脊椎动物的肌肉、腮、生殖腺、胚胎组织、消化腺、足、虹吸管等，脊椎动物的肝脏、肾脏、肠、脾、肌肉、腮、生殖腺以及植物和藻类的细胞等。

Nacci et al将苯并[a]芘添加到比目鱼食物中，发现鱼体只有肠道细胞DNA损伤具有统计意义。张青碧等人用小鼠肝细胞彗星实验检测饮用水氯化消毒前后的诱变性，结果表明：水源水和氯化消毒饮用水都能诱导动物细胞DNA损伤，经氯化消毒过后的饮用水其消毒产生的氯化副产物比水源水具有更强的致突变性。

2.1.3 动物生殖细胞DNA损伤检测。对生殖细胞的DNA损伤检测是遗传毒性检测的一部分，也是基因毒性检测的一部分。越来越多的环境毒物暴露是此项检测越来越普遍的一个最重要的原因，尽管这些检测的方法基本一致，但对人类“趋利避害”还是具有重要意义的。

王晓平等人用不同剂量的甲醛对小鼠睾丸细胞进行染毒，用彗星实验检测睾丸细胞的损伤效应，结果显示：甲醛在10、25、50μg·L-1时具有断裂效应，在75μg·L-1时既有断裂也有交联作用。甲醛致睾丸细胞断裂的临界浓度在10μg·L-1左右，峰值浓度在50μg·L-1附近。郭红刚等为了研究丙烯酰胺致小鼠睾丸细胞和外周血淋巴细胞DNA的损伤及修复情况，结果表明，两种组织细胞可能是丙烯酰胺的作用位点；机体对丙烯酰胺造成的遗传损伤有一定的修复能力；与淋巴细胞相比，睾丸细胞对丙烯酰胺导致的遗传损伤更为敏感。高红霞等人选取三类污灌农田土壤为研究对象，地下水灌溉的土壤为对照，提取土壤中的有机物，并用彗星试验检测土壤有机提取物对原代大鼠肝细胞DNA的损伤情况。结果显示四组有机物的三个剂量组（0.3g·mL-1、0.6g·mL-1、0.9g·mL-1）均可导致DNA迁移长度增加，拖尾率增高；污灌的三组与对照组相同染毒剂量比较，DNA迁移长度增加，拖尾率增高。

2.2 对植物细胞DNA损伤检测

1996年Kappen首次将彗星实验技术引入到植物研究中，利用彗星实验检测到遗传毒性物质能够引起蚕豆根尖DNA双链断裂。近些年来，彗星实验在植物环境检测、污染治理和生态评估等方面的应用已经非常广泛和

普遍。

张旭红等人以蚕豆为研究对象，采用碱性、半碱性和中性彗星实验方法研究Cd对植物DNA的损伤，结果表明Cd能够引起蚕豆叶片DNA损伤，但是不同Cd浓度引起DNA损伤的种类不同。林爱军等研究证实，骨炭灰能够有效降低水溶态和交换态Pb、Cr、Cu的浓度，从而可以有效降低重金属在植物体内累积，减少因重金属污染对食物链上游生物的危害，通过植物彗星实验发现，加入骨炭灰后植物细胞DNA损伤明显降低。

2.3 对人体细胞DNA损伤检测

对人体细胞DNA损伤检测大体分为两大类：一类是对经常接触有毒有害物质的正常人群损伤检测；另一类是对患者或者培养的人类癌细胞或者病变细胞的损伤检测。这些检测应用广泛，但方法上还需略微改进。

2.3.1 对人体正常细胞DNA损伤检测。李林鹏等人为了评估三氯生（TCS）和三氯卡班（TCC）对人体的遗传毒性，利用彗星实验研究两种污染物对正常人肝细胞（L02）DNA的损伤效应。结果发现：三氯生和三氯卡班皆能引起人体肝细胞的DNA损伤，并呈现显著的剂量-效应关系和时间效应关系。相比于TCS而言，L02细胞对TCC更为敏感，在低暴露剂量（2.38μmol·L-1）下就可以引起DNA断裂损伤。孙明霞等人将人晶状体上皮细胞（hLECs）置于sXc-1800细胞辐照系统内连续辐照2h，辐照强度[比吸收率（specific absorption rate，SAR）]辐照A、B、C、D组分别为1.0、2.0、3.0、4.0W·kg-1，辐照后0.0、0.5、1.0h分别进行彗星实验，检测细胞DNA的损伤及其修复情况，结果表明：SAR≤3W·kg-1的1.8GHz手机微波短期急性作用对体外培养的hLECs的DNA不产生或产生可修复的损伤，对其后的细胞增殖情况亦无影响，4.0W·kg-1的辐照剂量可导致细胞DNA不可逆性损伤，使细胞的增殖率下降。

对人体细胞的检测因其直接性，往往能够直观地说明人体受损伤情况及保护和回复情况。理论上人体细胞是可以做这种检测的，这对于人体健康来说具有很重大的意义。但实际上并非如此，尽管人体细胞培养已经很成熟，但人体对于异型生物质、毒物等的处理机制还是不能通过这些直接检测手段完全验证。体内体外实验综合运用又具有一定的实行障碍，所以对人体细胞的DNA损伤检测结果和方法上的探讨是下一步彗星实验在人体细胞损伤检测上的一个重要方向。

2.3.2 对人体病变细胞DNA损伤检测的应用。孙丽蕊等人取15例宫颈鳞癌放疗患者放疗前及放疗累积剂量为0Gy、10Gy、20Gy、30Gy、40Gy、50Gy、60Gy时的外周静脉血，以彗星实验检测淋巴细胞的DNA损伤，结果表明：各累积剂量组淋巴细胞DNA拖尾率比照射前显著升高（P<0.01）。史梦等用彗星实验检测不同浓度过氧化氢（H2O2）诱导的K562细胞、伊马替尼预处理K562细胞的DNA损伤模型；用彗星实验对各组细胞在DNA损伤后的修复进行动态观测。结果显示，经伊马替尼预处理的K562细胞修复时间为120min，与未处理组修复时间60min相比，前者DNA损伤修复时间明显延长（F=97.79，P<0.05）。

对病变或者癌症细胞的DNA损伤检测属于医学检测的范围，通常是被用作一种验证实验来进行。而且需要将彗星实验标准定量化，实验结果才能更有用、有效。因此要与其他实验结合才能更好地说明某种物质的损伤程度或者某种损伤的机制。

3 展望

彗星实验作为一种检测真核细胞中DNA双链单链断裂的方法已经广泛应用到遗传毒理、环境生态监测、临床、饮食、氧化应激以及细胞凋亡等研究。在中国尤其是从2002年至今，该方法已被熟练应用到DNA损伤检测中，但对于微生物和原生动物的DNA彗星实验一直很少，这主要是由于微生物和原生动物的自身结构及DNA含量少等原因造成的。但由于微生物、原生动物对于环境污染程度具有良好的指示作用，因此微生物、原生动物的彗星实验成为彗星实验发展的一个新方向。但在实际应用过程中彗星实验缺乏一个针对特定细胞相对标准的实验体系，而且对DNA损伤检测结果评价缺乏机制性的探讨。

彗星实验的未来发展趋势：一是针对目标细胞进行相应的实验方法上的创新改进；二是对于某些实验中最主要的步骤要标准化；三是彗星实验的评价结果分析要透彻；四是对于微生物和原生生物等其他真核生物的应用。随着彗星实验技术的不断发展和完善，相信彗星实验可以在解决实际科学问题方面以及实际应用方面都会取得卓越的成绩。

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基金项目：环保公益项目（201109039）。

作者简介：陈果（1976-），男，沈阳环境科学研究院工程师，研究方向：危险废物处置与污染场地修复技术。

（责任编辑：陈 洁）