KaiB调控蓝藻生物钟振荡的分子机制

杨丽婷 综述，刘　森 审校



·综述·

KaiB调控蓝藻生物钟振荡的分子机制

杨丽婷 综述，刘森 审校

[摘要]蓝藻PCC7942的基因簇KaiABC编码的KaiA、KaiB及KaiC蛋白对单细胞蓝藻的生物节律非常重要。蓝藻翻译后生物钟是受一系列生物化学反应控制的，其中包括磷酸化反应、ATP水解、单体的交换以及各种分子构象的变化，从而维持了生物振荡的准确与精密。本文对近些年来KaiB在翻译后振荡体系中参与Kai蛋白的相互作用而共同调节生物振荡，对ATP酶的影响及诱导KaiC单体的交换等一系列过程进行了综述，并介绍了KaiB与信号输出蛋白SasA的竞争关系，这对揭示体外生物钟的工作机制有着非常重要的意义。

[关键词]KaiB蛋白；磷酸化循环反应；单体的交换；ATP酶活性；SasA

作者单位：443002湖北宜昌，肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，三峡大学医学院

引用格式：杨丽婷,刘森.KaiB调控蓝藻生物钟振荡的分子机制[J].东南国防医药，2016,18(1):68-72.

生物节律现象广泛存在于生物界，而且越来越多的研究报道显示：无论是原核单细胞有机体、高等动植物还是人类的许多生理代谢活动都是在生物钟控制下进行的。蓝藻是已知的具有昼夜节律生物钟的最简单模式生物，为阐明昼夜节律的基本分子机制带来很大便利，其KaiA、KaiB及KaiC三种核心蛋白维持的生物振荡，不依赖于DNA转录水平与RNA翻译水平调控的转录/翻译负反馈回路(Transcriptional/Translational Feedback Loop, TTFL)，称为翻译后振荡(Post-Translational Oscillation，PTO)[1]。更为重要的是，KaiA/KaiB/KaiC体系是目前唯一能在体外重组的、翻译后振荡的生物钟体系，并且生物钟所具有的自我维持性、周期性及温度补偿性都可以由KaiA、KaiB、KaiC及ATP在试管条件下重现[2]。因此，该体系对于体外研究蛋白质相互作用网络模式具有重要意义，对理解昼夜节律振荡器的形成机制也具有重要价值。本文对近些年来KaiB在振荡体系中参与Kai蛋白的相互作用而共同调节生物振荡，KaiB对ATP酶的影响及诱导KaiC单体的交换等一系列过程进行了综述，并介绍了KaiB与信号输出蛋白SasA的竞争关系，这对揭示体外生物钟的工作机制有着非常重要的意义。

1KaiABC生物节律简介

蓝藻生物钟基因是一个由KaiA、KaiB及KaiC基因组成的基因簇KaiABC，其中KaiA单独转录，KaiB、KaiC共同转录，它们的表达产物KaiA、KaiB及KaiC蛋白共同组成生物钟的中央振荡器，产生昼夜节律的计时机制。具体表现有：基因簇转录水平呈高低的节律性变化，KaiC蛋白磷酸化水平高低的节律性变化。在转录水平，KaiA蛋白会增加KaiB与KaiC的转录，同时其产物KaiC蛋白会抑制KaiA基因的表达，一旦KaiA基因的表达受抑制，KaiA蛋白量会下降，KaiB与KaiC的转录效率也随之下降，即KaiB与KaiC的转录水平呈现出节律性。在蛋白水平，核心蛋白KaiC同时具有自激酶(Autokinase)和自磷酸酶(Autophosphatase)的活性，自激酶活性的存在，使KaiC能够在自身亚基间相互磷酸化；而自磷酸酶活性则使磷酸化的KaiC能够自动去磷酸化，这两种酶活性的存在使KaiC发生磷酸化-去磷酸化周期性变化具备了可能性[3]。KaiA蛋白通过促进KaiC蛋白的磷酸化与抑制KaiC蛋白的去磷酸化，提高KaiC的磷酸化水平，而KaiB是KaiC磷酸化的负调控因子，能降低由KaiA增强的KaiC的磷酸化水平，使KaiC自身去磷酸化，在KaiA与KaiB的共同作用下，KaiC从整体上表现出磷酸化和去磷酸化的周期性振荡[4]。

Kai蛋白与其他生物钟蛋白没有相似性，只要破坏这三种蛋白中的任何一种就将会使生物节律紊乱，而KaiC蛋白的生物化学性质是了解生物钟特性的关键。KaiC蛋白的功能形式是由六个单体聚合而成的同源六聚体，每个单体有两个亚基，即N端的CI亚基与C端的CII亚基，每个CII亚基有431位的丝氨酸(S431)残基和432位的苏氨酸(T432)残基两个磷酸化位点。因此，每个KaiC单体就有四种可能的磷酸化状态，分别呈现出不同的功能。具体的表现为为KaiC磷酸化/去磷酸化循环的四个步骤：a. T432的磷酸化；b. S431的磷酸化；c. T432的去磷酸化；d. S431的去磷酸化(图1)。这2个磷酸化位点的磷酸化和去磷酸化严格按照上面的顺序进行，形成一个精密的时间记录元件，单向记录时间的流逝[5]。

磷酸化时相，在KaiA的作用下，处于低磷酸化状态的KaiC(TS)先T432的磷酸化(pTS)，然后 S431的磷酸化(pTpS)；去磷酸化时相，在KaiA与KaiB共同作用下，处于高磷酸化状态的KaiC(pTpS)先T432的去磷酸化(TpS)，然后 S431的去磷酸化，KaiC回到低磷酸化状态(TS)，一个循环结束，新的循环开始图1　KaiC的磷酸化/去磷酸化循环

2Kai蛋白的结合位点

目前已经证实KaiA有两个结合位点，在磷酸化时相与去磷酸化时相分别与KaiCII的A-Loop结构域[6]和KaiB[7]相互作用。KaiA二聚体对低磷酸化的KaiC的亲和力高于处于高磷酸化状态的KaiC[8]，当KaiC的CII亚基处于低磷酸化状态时，KaiA通过结合C端的A-loop(488-497位)，增强KaiC的自激酶的活性同时减弱磷酸酶的活性，加速其向高磷酸化状态的转变，从而促进KaiC磷酸化反应。而KaiB则选择性的结合到处于高磷酸化状态的KaiC上，通过抑制KaiA的活性，从而使KaiC在磷酸酶的优势活性下，向低磷酸化状态转变[9]。定向标记的电子自旋共振分析表明KaiA-KaiB有瞬间的相互作用。电子自旋磁共振显示KaiA的C端与KaiB相互作用，而KaiA的N端对KaiA-KaiB的相互作用不是必需的。进一步研究显示，KaiA缺失1-179位就不能与KaiB相互作用[6]，所以KaiA连接N端与C端的连接区域(147-170位)，对KaiA-KaiB的相互作用非常重要。进一步研究显示KaiC的N端能够增强ΔNKaiA-KaiB(ΔNKaiA为KaiA缺失1-135位)的相互作用[10]。

KaiB的主要作用是结合磷酸化状态的KaiC，阻止KaiA与KaiC的相互作用，从而促进KaiC向去磷酸化状态转变，但KaiB与KaiC相互作用区域迄今尚不明确。电镜、小角散射实验表明KaiB是和KaiC的CII亚基结合的，那么KaiB最可能是通过结合在KaiC的CII亚基端，直接占据KaiA的结合位点，或形成空间位阻，来影响KaiA与KaiC的结合；Villarreal等[11]的研究，较好地支持KaiB-KaiC相互作用发生在CII端的ATP沟槽。Chang等[12]利用NMR实验表明KaiB和KaiC反应发生在CI亚基由一些非极性氨基酸及带负电的氨基酸残基组成的B-loop(116-123位)，但具体的作用区域目前还不明确，且存在争议。一般情况下，KaiB是不能结合到KaiC的CI亚基上的，因为这个结合位点是隐藏的。但是当CI亚基和CII亚基之间有堆积力的作用，使CI亚基构象发生变化，暴露出KaiB结合位点时，KaiB才能结合上去[12]。这说明KaiB有也可能结合在CI亚基来调节KaiC的磷酸化程度。

综上所述，KaiB可能结合在KaiC的CI亚基和CII亚基。如果KaiB结合在CII亚基上则主要可能是通过直接影响CII亚基的表面静电势(electrostatic surface potential，ESP)调节KaiC的运行，也有可能是阻碍KaiA与KaiC的结合位点来调节KaiC的振荡，还有可能是调节ATP与KaiC的反应来调节KaiABC的正常运行。如果KaiB结合在CI亚基上，则可能是从KaiC的结构稳定性方面来间接调节KaiABC反应。虽然KaiB与KaiC的具体结合位点存在争议，但是KaiB的结合都可以占领或影响KaiA与KaiC的结合，来实现使KaiC从高磷酸化状态向低磷酸化状态的转变[13]。

3KaiB结合KaiC时的聚合形式

KaiB是三种蛋白中最小的一个，结构类似于硫氧还蛋白折叠的二聚体或四聚体，单体由102个氨基酸组成。KaiB蛋白会发生自身相互作用而形成二聚体、四聚体甚至多聚体。最近的研究发现，生物钟蛋白KaiB不具有自激酶活性，但可以与KaiC直接发生相互作用而参与生物钟的调控，并且KaiB的不同的聚合形式之间的平衡和转化，对核心振荡器的节律性有影响[14]。那么，KaiB究竟以何种形式与KaiC结合的呢？

基于以前的研究我们认为KaiB是以稳定的同源四聚体存在，但它的四聚体不能与KaiA或KaiC相互作用，只有当聚合物解聚后才有此功能。KaiA就是通过加速KaiB四聚体的解离，从而促进KaiB与KaiC的结合。同样的方法，KaiC促进KaiB与KaiA的相互作用。已经有研究显示，KaiB是以二聚体的形式结合到CII亚基上的，KaiB二聚体与CII亚基的顶端相互作用形成三层夹心的结构[15]。Heck等用质谱的手段发现在与KaiC的结合过程中，KaiB的单体、二聚体、四聚体等形式都有参与，他们指出KaiB单体是和KaiC发生反应的基本单位，而且不排除KaiB能和KaiC的CI亚基、CII亚基都发生反应[16]。因此，KaiB的单体、二聚体和四聚体形式的动态变化，可能与KaiC的磷酸化振荡息息相关。而KaiB的尾端可能通过影响单体-二聚体-四聚体的平衡而影响其聚合状态，然而只有二聚体与KaiC发生相互作用，不同时期可能KaiB有不同的聚合体形式和KaiC发生相互作用[17]。我们通过构建不同的共价连接寡聚体的策略，研究了KaiA和KaiB蛋白的共价二聚体的功能，初步发现共价连接的蛋白对KaiC的振荡现象产生了很大影响，反映出寡聚体间动态转变对该振荡体系正常功能的重要性。相信对KaiA/KaiB/KaiC核心振荡体系的分子机制的进一步阐明，将有助于我们对蛋白质相互作用网络、生物振荡器以及高等生物昼夜节律现象等的深入理解。

4KaiB影响ATP酶的活性及诱导KaiC单体的交换

除了KaiC的磷酸循环，ATP的结合也是蓝藻生物计时机制的一个重要的生物过程。ATP的主要功能是为该体系提供能量、维持KaiC的六聚体功能状态以及为KaiC的磷酸化提供磷酸基团参与KaiC的磷酸化振荡。而KaiB通过影响ATP的结合而间接的影响到该体系的能量供给及KaiC功能六聚体的形成，从而阻碍KaiC的磷酸化循环的正常运行。

此外，KaiC是一个特殊的ATP酶，并且这种ATP酶的活性也呈现节律性与温度补偿效应，而且这种活性似乎还决定着KaiA/KaiB/KaiC振荡体系周期的长短：活性越高，周期越短；活性越低，周期越长[18]。KaiC上的ATP酶的活性主要受KaiB与KaiA调控，与KaiC所处的磷酸化状态无关[19]。KaiC的ATP酶和磷酸酶的活性是相互交融的。由于CI亚基结构的特殊性，只有ATP酶活性，且较稳定。如果KaiB与CI亚基结合则会影响CI亚基上的ATP酶活性，从而影响KaiC的磷酸化振荡[10]。此外，KaiB可能通过结合到KaiC的CII亚基ATP结合槽上，影响ATP的结合，从而来调节KaiC磷酸化振荡。当KaiC达到一定的磷酸化程度后，其CII亚基的激酶活性由于KaiB对ATP结合槽的影响而转向为ATP合成酶活性和ATP水解酶活性，从而进入去磷酸化相位[20]。因此，从一定意义上可以说，KaiB是KaiABC磷酸化振荡体系的核心调节元件，该调控受到ATP结合比例的影响。

另外，KaiB通过影响ATP的结合诱导KaiC单体的交换。很多实验都证实在KaiC的磷酸化循环过程中，KaiC六聚体与单体及另外的KaiC六聚体会发生亚基的交换，即KaiC六聚体存在不断的解聚与再聚合过程[5]。研究表明，任何状态的KaiC单体都可以和六聚体的KaiC中的单体发生交换，从而改变六聚体KaiC的磷酸化水平[21]，这对维持较高的振荡振幅是非常重要的。KaiC的CII结构域ESP在处于低磷酸化状态时是带正电的，在转向高磷酸化状态时分子表面就会累积负电荷；KaiB的C末端富含酸性氨基酸，而ATP是该区域中唯一一个与KaiB尾巴带有相同电性的分子。因此，KaiB很有可能定向的与KaiC相互作用而将其聚合体分离为单体及干扰ATP的结合。如果KaiB将它的尾巴插入到KaiC的两个亚基之间，ATP的结合位点就会被破坏，从而减弱亚基之间的相互作用，最终导致亚基的分离甚至是促成他们之间的交换[22]。因此，KaiB除了抑制KaiA的功能，还可能用它带负电荷的C末端减弱KaiCII亚基的相互作用及减弱ATP酶的活性甚至是替换ATP。KaiC的CI亚基与CII亚基以及这两个亚基的相互作用，对这种酶活性的转变起关键作用[23]。综上所述，KaiB可以通过影响ATP的结合、影响ATP酶的活性及诱导KaiC单体的交换而间接的调控KaiC的磷酸化振荡(图2)。

图2　KaiB调控KaiC的磷酸化振荡

5KaiB与SasA竞争KaiCII同一结合位点

信号输出蛋白SasA，是组氨酸激酶感受器，最初的研究表明SasA与KaiC有相互作用，并且该作用发生在SasA的N端结构域(1-97位)，进一步的研究又发现他们的相互作用也是有节律性的。SasA-KaiC复合物的SAXS和EM的综合结果显示，两个SasA的N端结合在KaiCII上KaiB的结合位点上，并且对之后KaiC的磷酸化状态敏感。非变性PAGE胶显示：SasA与KaiB都不结合KaiCI；SasA与KaiB 两种蛋白竞争性的结合到KaiCII结构域上；SasA结合KaiC比KaiB结合KaiC更紧密。简言之就是SasA与KaiB竞争性的结合到KaiCII结构域上，这个结论就可以很好的解释在KaiB的活性被抑制的时候，SasA可以替代KaiB与KaiC发生相互作用[24]。综上所述，SasA[25]与KaiB[12]都结合到KaiCII结构域上，并且KaiB与SasA竞争同一结合位点B-Loop。

N-SasA与KaiB有很大一段相似序列，它可以与KaiC直接相互作用。进一步研究表明SasA与KaiB有许多相似的特性，其中包括ESP，但是N-SasA水溶液的核磁(NMR)图显示N-SasA与KaiB有很重要的不同点。SasA与KaiB的一个显著的不同就是SasA单体就可以感知KaiC的磷酸化状态，但目前没有充足的证据证明KaiB也是以单体的形式结合到KaiC上的。另外，SasA与KaiB的C末端尾巴有很大的不同，KaiB的C末端显著性的特征是富含酸性残基的氨基酸，而SasA的C末端作为二聚体的连接子没有这一特征[22]。KaiB只能结合到S431残基磷酸化状态的KaiC上[26]，而SasA能够结合任何磷酸化状态的KaiC[27]，但是KaiB能替换处于任何磷酸化状态的KaiC上结合的SasA[14]。KaiC的N端直接与SasA相互作用接受时间信号，并促进SasA的磷酸化循环然后将磷酸基团转移给转录因子RpaA，RpaA磷酸化而被激活[28]。在主观黑暗条件下，KaiB-KaiC复合物激活CikA，从而诱导RpaA的去磷酸化而被抑制[29]。因此，KaiB-KaiC结合的节律可以通过调控随后对RpaA具有相反作用的SasA与CikA而调控生物钟信号的输出。

6结语

生物钟是生物适应环境周期性变化的一种内在机制，具有调控代谢、生理稳态、睡眠及衰老等重要的生理功能，生物钟的紊乱会严重影响健康或生存。近年来，陆续有研究证明了生物节律紊乱与皮肤病、心血管疾病及癌症等疾病的发生发展存在着密切关系。生物钟研究以同时考察时间和空间四维尺度的方式来研究生命现象的节律性动态变化，可以更为准确地揭示生命现象的规律及内在机制。蓝藻生物钟体系是目前已知最简单的生物钟体系，但机制又非常复杂，虽然经过近30年的研究，仅就KaiB仍有诸多未解决的问题：KaiB与KaiC的具体结合部位，结合形式，结合状态等都存在一些争议，有些观点甚至截然相反。KaiB与KaiC的相互作用对磷酸化时相转向去磷酸化时相有非常重要的意义，但是目前其中的机制研究仍不清楚。对Kai复合物的研究显示，KaiB存在单体、二聚体及四聚体，但是KaiB的结合模式，相互作用的化学计量以及确切的结合表面仍存在诸多疑点。对于这些问题的解决，有待更多的实验数据的出现。通过对这些生物机制深入、系统的研究，为人们更好的适应生存环境提供了科学合理的指导，同时也为相关疾病的研究奠定了理论基础。

【参考文献】

[1]Teng SW, Mukherji S, Moffitt JR, et al. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback[J]. Science, 2013, 340(6133): 737-740.

[2]Nakajima M, Imai K, Ito H, et al. Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro[J]. Science, 2005, 308(5720): 414-415.

[3]Iwasaki H, Williams SB, Kitayama Y, et al. A KaiC-interacting sensory histidine kinase, SasA, necessary to sustain robust circadian oscillation in cyanobacteria[J]. Cell, 2000, 101(2): 223-233.

[4]陈为群，刘松，刘森.蓝藻生物钟核心振荡器的分子机制研究进展[J].生物物理学报，2013, 29(11): 801-810.

[5]Ito H, Kageyama H, Mutsuda M, et al. Autonomous synchronization of the circadian KaiC phosphorylation rhythm[J]. Nat Struct Mol Biol, 2007, 14(11): 1084-1088.

[6]Kim YI, Dong G, Carruthers CW, et al. The day/night switch in KaiC, a central oscillator component of the circadian clock of cyanobacteria[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2008, 105(35): 12825-12830.

[7]Phong C, Markson JS, Wilhoite CM, et al. Robust and tunable circadian rhythms from differentially sensitive catalytic domains[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2013, 110(3): 1124-1129.

[8]Ma L, Ranganathan R. Quantifying the rhythm of KaiB-C interaction for in vitro cyanobacterial circadian clock[J]. PLoS One, 2012, 7(8): e42581.

[9]Nishiwaki T, Satomi Y, Kitayama Y, et al. A sequential program of dual phosphorylation of KaiC as a basis for circadian rhythm in cyanobacteria[J]. EMBO J, 2007, 26(17): 4029-4037.

[10]Tseng R, Chang YG, Bravo I, et al. Cooperative KaiA-KaiB-KaiC interactions affect KaiB/SasA competition in the circadian clock of cyanobacteria[J]. J Mol Biol, 2014, 426(2): 389-402.

[11]Villarreal SA, Pattanayek R, Williams DR, et al. CryoEM and molecular dynamics of the circadian KaiB-KaiC complex indicates that KaiB monomers interact with KaiC and block ATP binding clefts[J]. J Mol Biol, 2013, 425(18): 3311-3324.

[12]Chang YG, Tseng R, Kuo NW, et al. Rhythmic ring-ring stacking drives the circadian oscillator clockwise[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2012, 109(42): 16847-16851.

[13]Iwasaki H, Nishiwaki T, Kitayama Y, et al. KaiA-stimulated KaiC phosphorylation in circadian timing loops in cyanobacteria[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2002, 99(24): 15788-15793.

[14]Murakami R, Mutoh R, Iwase R, et al. The roles of the dimeric and tetrameric structures of the clock protein KaiB in the generation of circadian oscillations in cyanobacteria[J]. J Biol Chem, 2012, 287(35): 29506-29515.

[15]Pattanayek R, Williams DR, Pattanayek S, et al. Structural model of the circadian clock KaiB-KaiC complex and mechanism for modulation of KaiC phosphorylation[J]. EMBO J, 2008, 27(12): 1767-1778.

[16]Snijder J, Burnley RJ, Wiegard A, et al. Insight into cyanobacterial circadian timing from structural details of the KaiB-KaiC interaction[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2014, 111(4): 1379-1384.

[17]刘松，刘森.蓝藻生物钟核心振荡器的kaiB-kaiC相互作用的机制[J].生物化学与生物物理进展，2015, 42(3): 1-8.

[18]Murakami R, Miyake A, Iwase R. ATPase activity and its temperature compensation of the cyanobacterial clock protein KaiC[J]. Genes Cells, 2008, 13(4): 387-395.

[19]Terauchi K, Kitayama Y, Nishiwaki T, et al. ATPase activity of KaiC determines the basic timing for circadian clock of cyanobacteria[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2007, 104(41): 16377-16381.

[20]Mutoh R, Nishimura A, Yasui S, et al. The ATP-mediated regulation of KaiB-KaiC interaction in the cyanobacterial circadian clock[J]. PLoS One, 2013, 8(11): e80200.

[21]Yoda M, Eguchi K, Terada TP, et al. Monomer-shuffling and allosteric transition in KaiC circadian oscillation[J]. PLoS One, 2007, 2(5): e408.

[22]Pattanayek R, Williams DR, Rossi G, et al. Combined SAXS/EM based models of the S.elongatus post-translational circadian oscillator and its interactions with the output His-kinase SasA[J]. PLoS One, 2011, 6(8): e23697.

[23]Egli M, Mori T, Pattanayek R, et al. Dephosphorylation of the core clock protein KaiC in the cyanobacterial KaiABC circadian oscillator proceeds via an ATP synthase mechanism[J]. Biochemistry, 2012, 51(8): 1547-1558.

[24]Kageyama H, Kondo T, Iwasaki H. Circadian formation of clock protein complexes by KaiA, KaiB, KaiC, and SasA in cyanobacteria[J]. J Biol Chem, 2003, 278(4): 2388-2395.

[25]Chang YG, Kuo NW, Tseng R, et al. Flexibility of the C-terminal, or CII, ring of KaiC governs the rhythm of the circadian clock of cyanobacteria[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2011, 108(35): 14431-14436.

[26]Rust MJ, Markson JS, Lane WS, et al. Ordered phosphorylation governs oscillation of a three-protein circadian clock[J]. Science, 2007, 318(5851): 809-812.

[27]Valencia S, Bitou K, Ishii K, et al. Phase-dependent generation and transmission of time information by the KaiABC circadian clock oscillator through SasA-KaiC interaction in cyanobacteria[J]. Genes Cells, 2012, 17(5): 398-419.

[28]Takai N, Nakajima M, Oyama T, et al. A KaiC-associating SasA-RpaA two-component regulatory system as a major circadian timing mediator in cyanobacteria[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2006, 103(32): 12109-12114.

[29]Gutu A, O’Shea EK. Two antagonistic clock-regulated histidine kinases time the activation of circadian gene expression[J]. Mol Cell, 2013, 50(2): 288-294.

(本文编辑：张仲书)

(收稿日期：2015-11-08；修回日期：2015-12-08)

通讯作者：刘森，E-mail: senliu.ctgu@gmail.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21103098)

[中图分类号]Q6，Q7

[文献标志码]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.01.021