Tau蛋白在神经元细胞质和细胞核内的不同功能及其磷酸化对阿兹海默病的影响

廖依婧，高天毅，胡振良，李睿，沈建英

（华中科技大学同济医学院1第二临床学院，2组织学与胚胎学教研室，武汉 430030）

Tau蛋白在神经元细胞质和细胞核内的不同功能及其磷酸化对阿兹海默病的影响

廖依婧1，高天毅1，胡振良1，李睿1，沈建英2*

（华中科技大学同济医学院1第二临床学院，2组织学与胚胎学教研室，武汉 430030）

Tau蛋白的功能，现有的研究结果已经比较清晰，涉及多种胞内异常，包括自噬、轴质运输、神经极性的紊乱，以及胞质Tau蛋白分泌到胞外所引起的一系列变化。Tau蛋白在细胞质和细胞核内具有不同功能，在胞质中以微管相关蛋白（microtubule-associated proteins，MAPs）形式承担运输、细胞支架和细胞运动等功能；在核内大量存在于核仁中，并作为端粒成分保护核内DNA；糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）、磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine-monophosphate activated protein kinase，AMPK）、微管亲和调节蛋白激酶（microtubule-affinity regulating kinases，MARKs）和腺苷酸环化酶依赖的蛋白激酶（cyclic AMP-dependent protein kinase，PKA）对Tau蛋白异常磷酸化的影响，并由此讨论Tau蛋白在老年痴呆等神经退行性疾病中的可能作用。

Tau蛋白；神经退行性病变；DNA保护机制；翻译后修饰

微管系统是神经细胞的骨架成分，由微管蛋白和微管相关蛋白组成，Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白［1］。许多神经退行性疾病，包括阿尔兹海默病（Alzheimer＇s disease，AD）、帕金森病（Parkinson＇s disease，PD）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、朊毒体病（prion disease）等都有一个共同的病理特征，即由于微管相关蛋白tau的聚集，形成神经原纤维缠结（neurofibrillary，NFTs）异常沉积于脑内，进而产生神经退行性变，这类疾病统称为tau病变［2，3，4］。

1 Tau蛋白的分子结构

Tau是一种主要表达于神经元中的微管相关蛋白，表达来源于单一基因，编码区位于17号染色体长臂上，跨度约150kb，包含16个外显子［5，6，7］。Tau蛋白主要在神经系统中表达，但在肾脏、肺脏和睾丸中常也有表达。虽然Tau主要分布在轴突部位，但它也被发现表达于树突和胶质细胞之中［8，9］。现有的生化实验已经明确发现Tau蛋白通常以单纯未折叠形式或无意义形式存在。Tau的多肽链高度可变而位置不定，且只含有一小部分的二级结构（如α-螺旋，β-折叠等）。Tau蛋白含有C-末端的微管结合区和N-末端的突出物区，分别占全长的三分之一和三分之二。Tau蛋白微管结合区域又可分为真正的微管蛋白结合区域和C末端酸性区。微管结合区域含有三段或四段相似但不完全相同的31～32个氨基酸残基组成的重复序列，为R1、R2、R3和R4；突出区可以进一步分为N端的蛋白酸性区和C端的脯氨酸富集区两个部分（图1）。Tau蛋白是一个具有两端不同电极的偶极子［10］，这种不等电的结构恰是tau蛋白和微导管和其他配对因子之间相互作用的关键所在，也是其内部折叠和聚集的不可缺少的部分［11］。

图1 Tau基因与分子结构。-1-14代表人17号染色体长臂上的17个外显子，R1-R4为tau蛋白上与微管蛋白结合的区域Fig.1 Tau gene and the domains of Tau protein.-1-14 represent the sixteen exons on 17q21；R1-R4 represent the binding regions ofmicrotubule

Tau蛋白有6种长度不同的异构体，这六种异构体由352～441个氨基酸残基组成，其主要差异在于N端和C端重复序列的多少。神经元发育过程中，tau蛋白的表达晚于其他微管相关蛋白，各亚型的分布随年龄的增长而各有不相同。胎儿脑中的Tau蛋白主要为最短的3R0N亚型，神经发生的齿状回新生细胞也含有较高比例的3R Tau蛋白亚型［12］；在成年人的大脑中，3R、4R异构体的数量比趋近于1，而且这六种Tau蛋白异构体均可在成人大脑中表达。Tau蛋白在正常细胞周期中的作用是聚合和稳定微管，尤其是在轴突中，调节神经的生长和运动变化。这一功能主要由微管结合区域R2、R3调节，而R2、N1、N2的的缺失却可以使Tau蛋白不能与微管蛋白结合从而不能调节微管的聚合和稳定［13］。

2 Tau蛋白在神经元中的定位和作用

Tau主要分布于神经元，也存在于一些非神经元细胞中，如Hela细胞、未成熟的成纤维细胞、淋巴母细胞等。大多数微管连接蛋白和微管蛋白连接体，是通过组装和分解的重复循环来达到稳定微管的作用。这些微管相关蛋白中，MAP2和Tau蛋白研究的最为全面［14］。

MAP2和Tau蛋白在大脑神经元的不同部位共同促进微管蛋白组装和聚合。在不同胚胎发育水平的大脑中，不成熟的MAP2和Tau蛋白效率更低，故胚胎期大脑的微管要比成熟大脑中的微管更为不稳定。Tau蛋白是热稳定的低分子量蛋白（Mr 52000～68000），其在大脑中的确切定位目前仍不明确。早期运用免疫组织化学技术检测显示，Tau蛋白主要定位在神经元的轴突内［15］，MAP2集中存在于神经元的胞体和树突中［16］。Tau蛋白的磷酸化不仅可以使Tau蛋白自身沉聚，降低与微管蛋白间的结合力，减少Tau蛋白与微管蛋白间的结合，还可以增强与MAP2等微管相关蛋白间的结合力，与微管蛋白竞争微管相关蛋白，减少微管蛋白与微管相关蛋白的结合，导致神经元中的微管不稳定，最终使神经元变性萎缩，甚至凋亡。

Tau是多功能蛋白，可与众多配对因子结合，包括信号分子、细胞骨架元件和脂类而发挥不同的作用，其最重要的作用就是聚合微管蛋白。Tau蛋白以高度酸化的C末端与微管蛋白结合，通过磷酸化中和其所带的正电荷，改变Tau的形态结构并将其从微管蛋白上脱离下来［17］。在许多病理状态下，如高度磷酸化，Tau可自我聚合和沉积而从微管蛋白上脱离［18］。Tau蛋白还可以改变微管蛋白上与Tau蛋白的结合区及其毗邻区域，直接或间接的作用于微管蛋白。Tau蛋白的保护区对微管蛋白的间接作用可能影响微管蛋白自身之间的相互作用［16］。

2.1 Tau在胞质中的作用

胞质中，在生理状态下，Tau蛋白能调控微管组装、微管动力学和微管空间构象。Tau蛋白可调控细胞器如线粒体的轴突运输，在神经元的信号转导上亦扮演了重要的角色；Tau蛋白能促进质中微管蛋白的成核。微管蛋白成核是微管聚集的起始，这一过程在维持正常的细胞骨架结构上具有重要意义。Tau蛋白在发育中也发挥着重要功能，如轴突的建立和识别（神经元极性发育）［19］以及轴突的后续生长［20］和髓鞘形成等。

有报道表明，Tau通过磷酸化可参与细胞发育的调节［21］。Tau蛋白的微管结合区域、突出区和酸性区有不同的功能，在微管结合域重复片段中N端的18个氨基酸残基被认为具有最强的微管蛋白结合能力，重复片段可以结合微管，促进微管自聚集并稳定轴突部位的微管。Tau蛋白与微管蛋白的结合，可促进微管的延长和稳定。Tau蛋白结合微管蛋白有两种方式：结合在微管蛋白的表面和插入微管蛋白中形成一个共同体。同时，Tau蛋白和微管相关蛋白（MAPs），如神经元蛋白MAP1A、MAP1B、MAP2，和非神经元蛋白MAP4一样，在微管结合域内或微管结合域周围含有一段保守区域。由此推测，这些蛋白具有共同的基因起源并有相似的作用［22］。突出区的具体功能至今为止还没有完全被发现，有研究称Tau蛋白的这个区域决定突触中微管和神经元树突之间的空间大小，这段区域还可能和其他细胞骨架蛋白相互作用，如神经质膜等［23］。这些功能涉及细胞骨架的整合和神经元内的信号通路。由于酸性区的存在，突出区域还可能包括阳离子结合区域，如Fe离子等。另一组实验表明明，这个区域还可能通过和PLC-γ和Src等蛋白激酶相结合，进而参与细胞信号转导的某些过程［24］。

2.2 Tau在核内的作用

Tau蛋白不仅仅存在于胞质中，还存在于胞核中，尤其是核仁组织区，特殊的定位提示Tau蛋白可能与核酸存在互补关系。近年来的研究［25］发现，Tau蛋白能和不同来源的双链DNA以序列非特异性结合，提高DNA的Tm值，即可在温度升高时保护DNA的双链结构，还可以保护DNA免受氧自由基的攻击。最近研究表明，Tau蛋白可以在非磷酸化的条件下与双链或单链DNA聚集且结合，在活体状态下，这种相互作用保护了DNA使之免于变性。一些最新数据表明，Tau蛋白能诱导DNA结构改变，大约1分子Tau蛋白结合700bpDNA，表明Tau蛋白在DNA复杂结构组成上的巨大作用［26］。

在有丝分裂的细胞中，核内Tau蛋白和核仁组织区（nucleolus organizer regions，NORs）有密切的联系，在分裂间期细胞中，Tau蛋白在纤维高度密集的区域表现为具有核仁定位的能力［27］。真核细胞的细胞核中多种不同的染色体构成细胞核的功能划分，其中最好的例子就是核仁。不同的NORs的集合是核仁的重要部分，同时也是核糖体合成的部位［28］。荧光显微镜显示，在人类细胞中，核仁Tau蛋白簇有规律地围绕和分布在α-卫星状排布的环中心样的异染色质周围，且在有丝分裂的染色体中，tau蛋白与近端着丝的染色体的NORs有联系，其中包括rDNA和着丝粒周围的并列序列，提示核内Tau蛋白可能是核仁的空间组成的重要部分。

有报道表明，核仁Tau蛋白已位于近端着丝粒的染色体（acrontric chromosome）13、14、15和21号核仁组织区中的短臂上［28］。若这些染色体不分离则导致三倍体，其中只有21号三倍体的个体可以存活。许多患有21三体综合征的患者均在40岁之前患有AD。虽然21三体综合征与AD的病理关联尚未可知，但患者脑中淀粉前体蛋白在其一生中均可过表达，可以导致患者大脑中的β-淀粉过度产生，其原因可能是淀粉前体蛋白相关基因位于21号染色体上。同时AD患者的21号染色体的错误分离也比其他人更易发生［29］。

近端着丝粒染色体不分离的原因尚不明确，但是在人类有丝分裂的卵细胞中，一些来自同源或非同源的近端着丝粒染色体因共有同一核仁，造成近端着丝粒染色体异位或不分离［30］。在NORs形成中，Tau蛋白可以与这些染色体相互作用，对细胞的正常或异常生理活动进行调控。

因此，Tau蛋白是核仁的主要组成蛋白，参与调控核仁的各项活动，磷酸化的核仁同时伴随有异常磷酸化Tau蛋白的存在，这又恰恰是神经纤维缠结的早期标志，为我们研究AD等神经退行性病变提供了一条可行思路。

3 Tau蛋白的磷酸化修饰

Tau蛋白能被丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等磷酸化、异构化、糖化、硝化、糖基化、乙酰化、氧化、聚胺化。异常的翻译后修饰是导致Tau蛋白异常的主要原因，其中磷酸化是Tau蛋白病变中Tau蛋白沉积的关键因素。可导致Tau蛋白磷酸化的激酶主要分为3类：脯氨酸介导的蛋白激酶（proline-directed protein kinase，PDPK），非脯氨酸介导的蛋白激酶（nonproline directed protein kinase，non-PDPK）和酪氨酸蛋白激酶［16］。

3.1 糖原合酶激酶-3

糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）［31］是一类属于PDPK的苏氨酸／丝氨酸特异性激酶。Ser-9（GSK-3α异构体）或Ser-21和Ser-389（GSK-3β异构体）位点被磷酸化可抑制其活性，而Thr-279（GSK-3α异构体）或Thr-216（GSK-3β异构体）位点的磷酸化可使之被激活［32，33，34］。

Tau蛋白有42个GSK-3的磷酸化位点，在AD患者脑内有29个GSK-3位点被磷酸化［35，36，37］。Tau蛋白病变中，GSK-3的水平直接影响神经系统退行性疾病的发展，并且与神经纤维缠结（NFTs）的增加有关。有研究显示，GSK-3的抑制因子锂有直接对抗神经系统变性的作用。锂剂可降低不易水解的Tau蛋白的量、Tau蛋白磷酸化水平和沉积程度。在AD患者的脑中有大量神经纤维缠结（NFTs），而NFTs的主要组成部分就是异常磷酸化的Tau蛋白［38］。

研究发现，在PD患者大脑的轴突聚集部分GSK-3β可导致Tau蛋白Ser-396位点磷酸化［39］，而Tau蛋白病变被证实与PD患者的大脑中出现LRRK2基因突变相关［40］。小蛋白DJ-1是PARK7基因编码的属于肽酶C56蛋白质家族的一个成员，是PD患者脑中突变率最高的基因表达产物。有研究者猜测，家族性PD相关的DJ-1L166P和DJ-1D119A突变可以增加GSK-3β的活性，从而增加Tau蛋白的磷酸化水平［41］。这种位于17号染色体上的突变关系到额颞叶型失智症并伴随PD的发生。相似的研究发现，另一GSK-3的抑制因子ARA014418被激活后［42］也可以出现类似的结果。

3.2 磷酸腺苷活化蛋白激酶

磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine-monophosphate activated protein kinase，AMPK）是一种属于non-PDPK的三聚体丝氨酸／苏氨酸激酶，通过磷酸化Tau蛋白上的Thr231、Ser396／Ser404等几个位点抑制tau蛋白与微管蛋白的结合。在许多Tau蛋白病变患者的大脑神经元中有大量磷酸化的AMPK（p-AMPK），即活化的AMPK［43］。完全缺乏Tau蛋白的神经元明显不受p-AMPK的影响，说明AMPK的活性形式可促进tau蛋白的沉积，但p-AMPK并未出现在纯化的PHFs（Tau蛋白形成的双股螺旋纤维）中，表明AMPK并未与Tau蛋白一起聚集［44］。

3.3 微管亲和调节蛋白激酶

微管亲和调节蛋白激酶（microtubule-affinity regulating kinases，MARKs）是一类属于non-PDPK的AMPK分支钙／钙调素依赖性蛋白激酶（CaMK）［45］。MARKs蛋白家族有4位成员：MARK1-4，它们与NFTs有明确的共定位，且在AD患者的大脑中高表达［46］。MARKs的磷酸化位点在Tau蛋白的重复序列KXGS基序上。MARKs磷酸化Tau蛋白导致其从微管蛋白上解离，使细胞骨架缺乏稳定性，从而促进tau蛋白的自身聚集［47］。Tau蛋白的MARKs磷酸化位点在Ser262，293，324和356［48］。最近的实验表明，MARK4在Tau蛋白的异常磷酸化中占据主要地位，同时MARK1和MARK2也可导致tau蛋白的磷酸化。MARK1和MARK2受DAPK激酶的作用，有实验通过敲除大鼠的DAPK基因发现，这些大鼠体内Tau蛋白的磷酸化程度有所下降，验证了DAPK激酶上调MARK1和MARK2活性，使Tau蛋白过度磷酸化［49，50］。

3.4 腺苷酸环化酶依赖的蛋白激酶

腺苷酸环化酶依赖的蛋白激酶（cyclic AMP-dependent protein kinase，PKA）是一类属于non-PDPK的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，既可以在体外又可以在体内催化tau蛋白的磷酸化［51，52，53］。PKA介导的Tau蛋白磷酸化可触发GSK-3β介导的一系列Tau蛋白的磷酸化反应在几个 AD相关的位点，如Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr217、Thr231、Ser396和Ser422等，并同时抑制如其他磷酸化位点Thr212和Ser404［50］。在体实验显示，成年大鼠侧脑室内注入PKA激活剂弗斯可林可使大鼠脑内的PKA激增，同时增加了Tau蛋白的磷酸化水平［54］。

4 Tau蛋白在阿尔兹海默症中的作用

阿尔兹海默病（AD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其典型特征为患者大脑皮层和海马区神经细胞间出现大量大量β-淀粉样蛋白沉淀即老年斑（senile plaques，SPs）、胞内出现神经元纤维缠结NFTs和神经元大量丢失。NFTs的主要成分正是过度磷酸化的Tau蛋白，过度磷酸化的Tau蛋白在AD患者的大脑神经元细胞中聚集形成配对螺旋状细丝（paired helical filaments，PHFs），进而形成NFTs。NFTs数量与AD患者所表现的症状轻重程度呈现正相关，NFTs在神经元内的沉积越多，AD患者的痴呆程度越重。

细胞内的NFTs主要由病理的双螺旋纤维（PHFs）聚集而成，而PHFs主要是由过度磷酸化的Tau蛋白（PHF-Tau）组成［55，56］。PHF-Tau与微管蛋白结合的能力显著下降，但PHF-Tau去磷酸化后仍具有与微管蛋白相结合的能力。体外实验中，磷酸化的Tau蛋白重复片段可自发聚集为二聚体，用高盐缓冲液处理后可形成PHF样细丝。在体内，神经元cdc2样蛋白激酶引起的Tau蛋白磷酸化促使Tau蛋白形成PHFs［57］。PHFs在神经元细胞胞体内聚集成NFTs，在突起中形成神经毡丝，继而沉积于神经元突起中，导致其萎缩变性，最终使神经元萎缩变性，失去原有功能［58］。

Tau蛋白还可以通过调节自身的磷酸化水平影响线粒体、p53等凋亡途径，从而影响神经元细胞凋亡。例如，过度磷酸化的Tau蛋白可以使抗凋亡因子β-连环素的磷酸化水平减低，降低β-连环素在神经元中抗凋亡的作用［59］；磷酸化的Tau蛋白可以削弱Aβ对神经元细胞的促凋亡调节［60-63］。同时，大量研究表明，过度磷酸化的Tau蛋白还可以破坏损神经元的结构和功能，如降低Tau蛋白与微管蛋白结合的能力［17］，Tau蛋白聚集沉积导致神经元细胞轴突转运障碍［18］、乙酰胆碱释放减少［64］、蛋白酶体活性抑制［65-68］，这些改变可能是AD患者脑中神经元进行性退变的重要原因，也是AD的发病病理基础之一。

5 总结

在本文，我们综述了Tau蛋白在细胞中的定位及其作用，其中胞质Tau蛋白多以微管相关蛋白形式存在，对微管的稳定性起重要作用；胞核Tau蛋白主要聚集于核仁，是核仁组织区（NORs）的重要组成部分，起保护DNA的重要作用。无论在胞质还是在胞核，Tau蛋白的磷酸化是其发挥作用的关键。然而，其中具体的机制仍不明确，尤其是Tau蛋白在胞核内如何与DNA和核仁区相互作用。我们猜测，在神经退行性疾病中，Tau蛋白起主要作用的部位在胞核内，这可能是未来有破解Tau病变的关键点。

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The different functions of Tau protein in the cytop lasm and nucleus of neuron and the effect of its phosphorylation on Alzheimer＇s Disease

Liao Yijing1，Gao Tianyi1，Hu Zhenliang1，Li Rui1，Shen Jianying2*
（1The Second Clinic College，2Department of Histology and Embryology，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

Current researches have drawn clear conclusions on the functions of Tau protein，which involve various intracellular anomalies including autophagy，axoplasmic transport and disorders of neural polarity，and a series of changes caused by secreted Tau protein.Tau has different roles in the cytoplasm and the nucleus.Asmicrotubule-associated protein（MAP）in the cytoplasm，it plays a part as cytoskeleton and also in cellular transportation and movement；while in the nucleus，it is abundant in the nucleolus and protects nuclear DNA as a telomere component.The effectof a variety of kinases on the abnormal phosphorylation of Tau is reviewed，including glycogen synthase kinase-3（GSK-3），adenosine-monophosphate activated protein kinase（AMPK），microtubule-affinity regulating kinases（MARK），and cyclic AMP-dependentprotein kinase（PKA）.The possible role of Tau in neurodegenerative disorders such as Alzheimer＇s Disease（AD）is then discussed.

Tau protein；neurodegeneration；mechanism of DNA protection；post-translationalmodifications

R741.02

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.06.014

2016-10-23

2016-12-18

2016年华中科技大学大学生科技创新基金

廖依靖，女（1995年），汉族，本科在读

*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）：729992019＠qq.com