野生卷丹不定芽诱导及再生体系的建立

蒋 瑶， 陈文波， 周增丽

(凯里学院 环境与生命科学学院， 贵州 凯里 556011)

野生卷丹不定芽诱导及再生体系的建立

蒋 瑶， 陈文波， 周增丽

(凯里学院 环境与生命科学学院， 贵州 凯里 556011)

为野生卷丹种质资源的繁殖、保存与利用提供依据，采用随机区组试验方法探究NAA、6-BA和2,4-D不同配比对野生卷丹鳞茎不定芽诱导及再生植株形成的影响。结果表明：相同6-BA 浓度下，生长素对野生卷丹鳞茎不定芽的诱导作用依次为NAA>NNA+2,4-D>2,4-D，最佳不定芽诱导培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L，平均产芽6.21个；最佳增殖培养基为MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，其增殖系数3.46；最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 1.0 mg/L，平均生根6.20个。

野生卷丹； 不定芽诱导； 再生植株； 组织培养

百合属(Lilium)是多年生草本鳞茎花卉植物，其栽培历史悠久，是绿化美化及切花生产的重要花卉之一[1]。但我国野生百合的利用率较低，大多数未得到应有的关注与保护，仍有很多优良的野生百合资源有待开发[2]。卷丹(Linliumlancifolium)又名虎皮百合、倒垂莲，为百合科(Liliaceae)百合属多年生草本花卉，花下垂呈橙红色，内面有紫色斑点，具较高的观赏、药用和食用价值[3-4]。其分布广泛，主要存在于我国河北、陕西、辽宁、吉林和贵州等17个省，在贵州黔东南州主要分布于黄平、施秉和雷山等地。卷丹的繁殖主要依靠常规的鳞片包埋、鳞片扦插、分株芽和分球等，长期的无性繁殖导致其品种退化，如病害严重、产量降低及品质下降等[5]。此外，由于市场的需求量增大，人为的滥采滥挖，野生卷丹群体受到严重的破坏，保护和扩大野生卷丹资源迫在眉睫。利用组培诱导不定芽建立再生体系可缩短生长周期，快速培育植株，有效解决其退化问题，保护其野生资源，满足市场需求[6]。

卷丹组织培养始于20世纪80年代[7]，以鳞片的研究最早且最易成功，为国内卷丹组织培养研究奠定了基础。目前，有关卷丹研究主要集中在遗传多样性[8]、核型分析[9]、功能基因克隆[10]、组织培养[11-17]、育种[5]以及种质资源保存[18]等方面。雷家军等[8]利用AFLP技术对卷丹遗传性状标记，并成功构建遗传图谱，为其分子育种奠定了基础。唐彪等[9]采用常规压片法对5个不同种源产地卷丹进行染色体观察发现，不同产地卷丹的染色体数目不同，为其有效保护和育种提供了背景资料。有研究[10]表明，利用RACE技术克隆的卷丹CCS基因已在其花瓣组织中表达。根据外植体的种类、采集季节和部位，其消毒试剂的选择及时间略有不同[19]，陈贵华等[20-21]分别进行了卷丹消毒试剂的相关研究。张传海等[22]研究发现，不同部位鳞片分化不定芽的效果总体上呈中层>外层>内层。苏箐华等[23-24]研究发现，卷丹再生体系形成途径主要有器官型、器官发生型和体细胞胚胎发生型等3种，器官发生型常用且形成再生植株的成功率较高。张鹏等[13]研究发现，以鳞片为外植体诱导不定芽形成再生植株的最适培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。谢杰等[25]用0.01～0.10 mg/L 2,4-D诱导宜兴百合小鳞茎产生愈伤组织并获得再生植株。体细胞胚胎发生型途径较其他2种途径复杂。翟彦[26]采用体细胞胚胎发生型途径成功获得“黄天霸”和“西伯利亚”花丝的胚性愈伤组织。沈琛[18]认为，玻璃化法超低温保存的最佳材料为继代2代卷丹组培苗茎尖，其液氮保存后存活率达93.3%，显著高于其他继代处理，达到保存种质资源的目的。

目前卷丹的组培研究主要以栽培种鳞茎为主，未见贵州省野生种的相关报道。为此，笔者以黔东南野生卷丹鳞片为材料，以MS为基础培养基，采用随机区组试验方法探究NAA、6-BA和2,4-D不同配比对不定芽诱导及再生植株形成的影响，以期筛选出各阶段最佳培养基配方，进一步缩短生长周期，为野生卷丹种质资源的繁殖、保存与利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 植物 野生卷丹，采自凯里学院后山。选用无病虫害，直径8～10 cm的鳞茎避光存放备用。

1.1.2 试剂 70%乙醇(AR，重庆川东化工)，0.1% HgCl2，6-BA、NAA、2,4-D，MS基础培养基(固体培养基，含蔗糖3.0%，琼脂0.7%，pH5.8)，试剂均为分析纯(AR)，其产地为天津科密欧(乙醇除外)。

1.1.3 仪器与设备 BSA124S电子天平(赛多利斯)，XQ-LS-75SⅡ高压蒸汽灭菌锅(上海博讯)，JH-1S超净工作台(北京科伟)。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒 将野生卷丹鳞茎最外2层去除，然后取较外层无病斑、较厚实且颜色均匀的鳞片用流水冲洗1～2 h，洗净并控干水分后放入超净工作台消毒：乙醇消毒30 s→无菌水清洗2～3次→HgCl2+1～2滴吐温-80消毒10 min→无菌水清洗4～5次后备用。

1.2.2 试验设计 该试验均以MS为基础培养基，并根据试验设计(表1)要求分别添加不同浓度配比的6-BA、NAA以及2,4-D。培养条件：光照时间16 h/d，温度25℃，相对湿度70%～75%。1)不定芽诱导培养。将已消毒的鳞茎切成0.8 cm×0.8 cm的小方块，接种到诱导不定芽培养基中。试验设9个处理，每个处理接种10瓶，每瓶接种外植体3个，3次重复。2)不定芽增殖培养。将初代培养诱导分化较健壮且无污染的丛生芽(芽高2～3 cm)分离成单株，接入不定芽增殖培养基中继代增殖培养。试验设9个处理，每个处理接种5瓶，每瓶接种不定芽3～5个。3)不定芽生根培养。将增殖培养的株高2 cm左右较强壮的丛生芽分离成单株，转接入不同的生根培养基中。采用1/2 MS作为基础培养基，试验设9个处理，每个处理接种5瓶，3次重复。

表1 野生卷丹外植体不定芽诱导、增殖和生根培养基添加激素的组成与浓度

Table 1 Hormone composition and concentration of different media for induction, multiplication and rooting of L.lancifolium adventitious buds mg/L

注：-表示未添加。

Note:-no addition.

1.2.3 观测指标 接种完成培养一段时间后，进行不定期观察、拍照。 1) 不定芽诱导培养。待其生长60 d后统计外植体诱导率及单颗外植体诱导不定芽的个数，计算平均产芽数和不定芽诱导率。2) 不定芽增殖培养。待其生长30 d后观察不定芽的增殖情况，观察不定芽长势并统计不定芽数量，计算不定芽增殖系数。3) 不定芽生根培养。待其生长40 d后统计其生根率、生根总数及单个鳞茎的生根数。

1.3 数据统计分析

数据采用Excel 2007软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度激素配比对卷丹鳞茎不定芽诱导的影响

2.1.1 不定芽的形成 从图1可见：将卷丹鳞茎接种在不同激素配比培养基中，4～5 d后小鳞茎由乳白色(图1A)变为青褐色(图1B)，6～8 d后鳞茎的内面出现浅黄色的小凸起，不定芽即将形成(图1C)；10～12 d后小凸起拔高形成不定芽，进一步形成丛生芽，且颜色转变为青绿色，而在小鳞茎的切口处出现不同程度的木质化(图1D)；20 d后不定芽抽生叶片，且芽的长势良好(图1E)。

注：A，乳白色鳞茎；B，青褐色鳞茎；C，鳞茎内表面出现小凸起；D，鳞茎切口处木质化；E，不定芽形成。

Note: A, ivory bulbs; B, greenish brown bulbs; C, small uplift on bulbs; D, lignification on the incision of bulb; E, formation of adventitious buds.

图 1 不同浓度激素配比处理卷丹鳞茎不定芽的形成过程

Fig.1 Formation process of adventitious buds cultured on media with different concentration and ratio of hormones

2.1.2 产芽数及诱导率 从图2可见： 1) 不同处理对鳞茎的诱导产芽数不同，除处理7～9外，其余处理产芽数均高于3个。其中：浓度一定，不同低浓度2,4-D和NAA能够促进不定芽诱导；处理7～9的诱导效果最差，处理4的诱导产芽数最多，为6.21个，且芽粗壮，长势良好，分布集中；其次为处理1，产生不定芽4.21个，数目相对较多且分布较稀疏。表明，相同NAA浓度下，6-BA浓度为1.0～1.5 mg/L均有利于诱导不定芽。处理2、处理3、处理5和处理6平均产芽3.38个，产芽数较少，长势一般。表明，6-BA表明，高浓度6-BA(2.0 mg/L)对不定芽的诱导有一定的抑制作用，导致出芽率低，且鳞茎褐化严重。2) 不同处理对鳞茎的诱导率不同，各处理诱导率均高于26%，平均达47.04%。其中，处理6的诱导率最高，达63.33%，处理8最低，为26.67%，处理1、处理2、处理4和处理5均高于45.00%，其余处理低于41.00%。表明，较低浓度NAA或2,4-D(0.5 mg/L)可促进卷丹鳞茎产芽；6-BA浓度为1.0～1.5 mg/L时可促进不定芽的诱导，6-BA浓度继续升高则导致诱导率降低，表明，高浓度6-BA抑制不定芽的生长，诱导效果不佳。从不定芽出芽数及生长状况看，处理4(MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L)培养基为最佳诱导不定芽培养基。

图 2 不同浓度激素配比处理卷丹鳞茎的产芽数与诱导率

Fig.2 Inducted buds number and induction rate ofL.lancifoliumbuibs cultured on media with different concentration and ratio of hormones

2.1.3 6-BA对不定芽的诱导 当NAA浓度为0.5 mg/L时，随6-BA浓度的升高，鳞片产生的不定芽数量增多且芽壮、葱绿。其中，6-BA浓度为1.0 mg/L时，不定芽长势较好，但数量相对较少，生长较慢(图3A)；当6-BA浓度达1.5 mg/L时，不定芽生长密集且长势良好(图3B)；当6-BA浓度达2.0 mg/L时，不定芽数量增多且粗壮，但分化芽的能力较慢(图3C)。表明，同一NAA浓度下，低浓度6-BA可促进不定芽的诱导，但超过一定浓度后，其诱导效果降低，分化能力减弱。

经方差分析，相同6-BA浓度下，不同生长素(NAA、2,4-D和NAA+2,4-D)均能诱导形成不定芽，其诱导效果依次为NAA>NAA+2,4-D>2,4-D。说明，低浓度生长素诱导不定芽具有促进作用，尤其是NAA效果最佳。

注：A～C中NAA浓度为0.5 mg/L，6-BA浓度依次为1.0 mg/L、1.5 mg/L和2.0 mg/L。

Note: A, Medium with 0.5 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA; B, Medium with 0.5 mg/L NAA + 1.5 mg/L 6-BA; C, Medium with 0.5 mg/L NAA + 2.0 mg/L 6-BA.

图 3 不同浓度6-BA 处理卷丹鳞茎的不定芽生长

Fig.3 Growth of adventitious buds cultured on media with different 6-BA concentration

2.2 不同浓度激素配比对卷丹不定芽增殖培养的影响

2.2.1 增殖生长 从图4可知，将生长健壮的不定芽转接入增殖培养基中，20 d后单芽大部分出现膨大，颜色转绿的现象；培养30 d左右，丛生芽的数目明显增多，大部分单芽能够分化出多个不定芽，且芽体更为粗壮。

注：A，不定芽开始增殖；B，不定芽膨大。

Note: A, Multiplication of adventitious buds; B, Expansion of adventitious buds.

图 4 不同浓度激素配比处理卷丹不定芽的增殖生长

Fig.4 Multiplication of adventitious buds cultured on media with different concentration and ratio of hormones

2.2.2 增殖系数和增殖率 从图5可知： 1) 增殖系数。处理4～6的增殖芽数最多，鳞茎粗壮且分化能力强，增殖系数>3，最大达3.46。其中，当6-BA浓度为1.0 mg/L时，随NAA浓度的增加，增殖系数呈先升后降的趋势。NAA浓度以0.3～0.5 mg/L较为适宜，高浓度NAA(1.0 mg/L)对鳞茎增殖无明显促进作用。当6-BA浓度为0.5 mg/L时，处理1～3的增殖芽数较多，3个处理以处理2的增殖系数最高，为2.88。当6-BA浓度达2.0 mg/L(处理7～9)时，增殖芽数相对减少，其鳞茎较为粗壮，但对不定芽的增殖作用较小。表明，较高浓度的6-BA对不定芽壮苗有一定的促进作用，但对丛生芽分化的促进效果较差，其增殖系数较低。2) 增殖率。各处理的增殖率均高于49.00%，且处理间存在差异。其中，处理1和处理4的增殖率达56.67%，且其不定芽的长势良好；其余处理的增殖率均低于54%，且其不定芽数量相对较少，长势较弱。表明，6-BA浓度为0.5～1.0 mg/L时，随6-BA浓度的增加，分化芽的数量依次增加，6-BA浓度继续升高，出芽个数则相对减少。

经方差分析，相同浓度6-BA条件下，不同浓度NAA对不定芽增殖的促进作用依次为0.5 mg/L>0.2 mg/L>1.0 mg/L，但处理间影响效果的差异不显著。其中，NAA 0.5 mg/L为不定芽增殖最佳浓度，较低浓度NAA对不定芽增殖效果相对较差，高浓度NAA对不定芽增殖有抑制作用。同时，在NAA浓度相同条件下，随6-BA浓度的升高，各处理之间诱导不定芽增殖的差异显著。其中，0.5～2.0 mg/L 6-BA对不定芽增殖生长具有促进作用。根据丛生芽的质量、增殖系数及长势等判断，处理5丛生芽的增殖系数最大，丛生芽较粗壮，长势良好，不定芽增殖的最佳培养基为MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L。

图5 不同培养基处理卷丹不定芽的增殖系数与增殖率

Fig.5 Multiplication coefficient and rate of adventitious buds cultured on different media

2.3 不同浓度激素配比对卷丹不定芽生根培养的影响

2.3.1 生根生长 从图6可知，经增殖后的茁壮不定芽移入1/2 MS基础培养基培养30 d后分化出褐色不定根，上有细小白色根毛，根系发达且粗壮；某些不定芽的芽体膨大，但根为白色且细小，无明显根毛。

2.3.2 生根量与生根率 由图7可知： 1) 生根量。无论是不定根的数量还是根系的发达程度，处理7(1/2 MS+NAA 1.0 mg/L)均优于其他处理，其平均生根数最高，达6.20个，根系相对发达且粗壮；其次为处理4，平均生根4.2个，根系发达程度一般；处理3、处理6和处理9在观察期内未发现不定根。由此表明，随NAA浓度升高，平均生根数逐渐减少；添加低浓度的6-BA对生根有抑制作用，6-BA浓度为0.1 mg/L时，处理3、处理6和处理9未产生不定根；不同浓度NAA对生根有促进作用。2)生根率。处理4、处理5和处理7的生根率均高于75%，其中，处理7的生根率最高，达93.75%；处理1、处理2和处理8的生根率为58%～75%，且生根较慢，不定根细小而少，生长一般；处理3、处理6和处理9的生根率为0，无不定根的生成。由此表明，随NAA浓度的升高，生根率呈下降趋势；6-BA浓度过高对生根不利。

经方差分析：相同浓度 NAA条件下，不同浓度6-BA对不定芽生根的促进作用依次为0 mg/L>0.05 mg/L>0.1 mg/L，且处理间差异显著。同时，相同浓度6-BA条件下，不同浓度NAA浓度对不定芽生根的促进作用依次为0.1 mg/L>0.5 mg/L>1.0 mg/L，且处理间差异明显。说明，不同浓度的NAA与6-BA配比对不定芽的生根有较大影响。根据丛生芽生根数及生根状况初步判定，处理7丛生芽的生根数最多，不定根粗壮，1/2 MS+NAA 1.0 mg/L为最佳不定芽生根培养基。

注：A，粗壮不定根；B，细小不定根。

Note: A, sturdy adventitious roots; B, tiny adventitious roots

图6 卷丹不定芽在1/2 MS基础培养基上的不定根生长

Fig.6 Growth of adventitious roots of adventitious buds cultured on 1/2 MS

图7 不同浓度激素配比处理卷丹的生根量和生根率

Fig.7 Rooting number and rate of adventitious buds cultured on different concentraticn of hormone

3 结论与讨论

1) 在6-BA浓度一定的情况下，NAA对野生卷丹鳞茎不定芽的诱导效果明显高于2,4-D和NAA+6-BA组合；最佳不定芽诱导培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L。与潘理云等[13，22，27]的结论一致。说明，该试验筛选的诱导培养基适合诱导贵州野生卷丹。

2) 野生卷丹鳞片诱导不定芽的最佳6-BA浓度为1.5 mg/L，其平均芽个数最多且不定芽生长情况良好，与石印等[15-16]的研究结论一致，但与钟灿等[17]的结果不同，可能与后者pH的调节及培养条件不同有关。

3) 6-BA浓度为0.2～1.5 mg/L时，适当的高浓度可以有效地提高卷丹继代增殖培养的增殖系数，但浓度过高则可能出现抑制作用。该试验继代增殖培养最适6-BA和NAA浓度分别为1.0 mg/L和0.2～0.5 mg/L，最佳生根培养基为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，与郭海滨等[4, 28-29]的结果一致；不定芽增殖培养最适6-BA浓度为0.5～2.0 mg/L。

4) NAA在一定浓度下能够促进生根，且生根效果较好。该试验最适不定芽生根培养基为1/2 MS+NAA 1.0 mg/L，与何薇等[3,11,30]的研究结果一致。但路森[31]研究发现，最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 0.3 mg/L，生根率为94%，较低浓度的NAA更有利于不定根的产生，与该试验的结果不一致，可能与百合品种有关。

5) 有关野生百合组培外植体的选择与消毒方法、激素的选择与配比、再生途径等方面的研究均已有相关文献报道[14]，但存在差异。该试验使用70%乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2+1～2滴吐温-80消毒10 min的处理方法能够大幅度地降低初代不定芽诱导时的污染，这与王昱淇[32]的结果一致。黄敏等[33]研究发现，外层鳞片用75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2浸泡18～20 min最佳；中层和内层鳞片用75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2浸泡14～16 min最佳。该试验仅选用中外层鳞茎进行研究，存在一定的局限性，今后将在外植体选择等方面进一步进行试验。

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(责任编辑： 王 海)

Adventitious Buds Induction and Plantlet Regeneration of WildLiliumlancifolium

JIANG Yao, CHEN Wenbo, ZHOU Zengli

(CollegeofEnvironmentandLifeScience,KailiUniversity,Kaili,Guizhou556011,China)

The induction and plantlet regeneration of wildL.lancifoliumadventitious buds cultured on media with different concentration and ratio of NAA, 6-BA and 2,4D were studied by a randomized block test to provide the scientific basis for reproduction, conservation and utilization of wildL.lancifoliumresources. Results:under the same 6-BA concentration,the induction ofL.lancifoliumadventitious buds is NAA >NNA+2,4-D>2,4-D.The optimum medium for induction ofL.lancifoliumadventitious buds is MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L and average 6.21 buds can be inducted. The optimum medium for multiplication ofL.lancifoliumadventitious buds is MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L and its multiplication coefficient is up to 3.46. The optimum medium for rooting ofL.lancifoliumadventitious buds is 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L and average 6.20 roots are produced.

WildLiliumlancifolium; adventitious buds Induction; regeneration plantlet; tissue culture

2015-09-11； 2016-05-05修回

贵州省科技厅自然科学研究项目“黔东南州野生百合耐热基因的克隆及其耐热性研究” [黔科合J字 (2014) 2153]；凯里学院博士专项基金项目“黔东南州野生百合高效离体培养及理化分析”(BS201332)

蒋 瑶(1982-)，女，副教授，博士，从事植物生物技术研究。E-mail: jiangyao0221@163.com

1001-3601(2016)05-0212-0097-06

S682.2

A

园艺·中药材

Horticulture·CHinese Herbal Medicimes