河北汉族人群谷胱甘肽硫-转移酶Z1的基因多态性研究

范志亮，冯晓娟，李春岩，尹少华，田新英*，任文博(.河北省邢台市人民医院神经内三科，河北 邢台 0500；.河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 050000；.河北省邢台市人民医院超声科，河北 邢台 0500；.天津市第五中心医院神经内科，天津 00000)



·论著·

民医院主治医师，医学硕士，从事运动神经元疾病和头痛病诊治研究。

河北汉族人群谷胱甘肽硫-转移酶Z1的基因多态性研究

范志亮1，2，冯晓娟3，李春岩2，尹少华1，田新英2*，任文博4(1.河北省邢台市人民医院神经内三科，河北 邢台 054001；2.河北医科大学第二医院神经内科，河北 石家庄 050000；3.河北省邢台市人民医院超声科，河北 邢台 054001；4.天津市第五中心医院神经内科，天津 300000)

[摘要]目的探讨河北汉族人群谷胱甘肽硫-转移酶Z1(glutathione S-transferase zeta 1，GSTZ1)基因多态性的分布情况。方法应用聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法，对210例河北汉族正常人进行GSTZ1 Lys32Glu基因多态性分析。结果河北汉族人群GSTZ1 Lys32Glu基因多态性符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，具有代表性。河北汉族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型频率分布和等位基因频率分布与伊朗人群、澳大利亚人群、德国人群、美国人群差异有统计学意义(P<0.05)；伊朗人群GSTZ1 Lys32Glu基因型频率分布和等位基因频率分布与澳大利亚人群、德国人群、美国人群差异有统计学意义(P<0.05)；澳大利亚人群、德国人群、美国人群GSTZ1 Lys32Glu基因型频率分布和等位基因频率分布差异无统计学意义 (P>0.05)。结论河北汉族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型频率分布和等位基因频率有其独特性。GSTZ1 Lys32Glu的基因多态性在地域和人种中的分布明显不同。

[关键词]基因；多态性；谷胱甘肽硫-转移酶Z1；河北汉族

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.02.003

谷胱甘肽硫-转移酶(glutathione S-transferases，GSTs)是体内Ⅱ相代谢酶家族的重要成员，在体内活性氧产物的代谢中发挥了重要的作用，并且是体内氧化/抗氧化系统的重要成员，可以保护机体免受氧化应激的损伤[1-2]。 GSTs基因多态性可能影响所编码的酶的功能，可以导致机体对一些活性氧产物和毒素的敏感性的改变，引起DNA损伤，导致疾病的发生[3]。GSTs多态性与肿瘤、系统性红斑狼疮、白癜风、慢性阻塞性肺病、帕金森病等易感性的关系已成为近年来研究的热点[4-5]。人类可溶性GSTs至少包括7 种,即alpa (A)、 mu (M)、pi (P)、theta (T)、zeta (Z)、sigma(S)、omega(O)。已证实GSTA1、GSTA2、GSTM1、GSTT1、GSTP1、GSTZ1 和GSTO1具有多态性，目前对GSTM1、GSTT1和GSTP1 的基因多态性研究较为深入，而对GSTZ1多态性的研究相对较少[6-7]。对我国GSTZ1基因多态性的分布鲜有报道。GSTZ1最常见多态性的是GSTZ1 Lys32Glu，导致A→G转换[8]。本研究主要探讨GSTZ1 Lys32Glu基因多态性在河北健康汉族人群中的分布，旨在了解疾病的发生机制,评估疾病发生的风险,筛检高危人群,为疾病的治疗及预防提供线索。

1资料与方法

1.1受试对象随机选取2013年12月—2014年2月无直接血缘关系的健康河北汉族个体210例， 男性122例，女性88例，年龄22~72岁，平均(49.27±9.34)岁。纳入标准：①汉族；②出生地及籍贯均为河北省；③定居河北省已三代及三代以上。排除标准：①罹患任何遗传倾向性疾病；②在取样当时，诊断出患有各种心脑血管疾病、肿瘤、精神异常及其他重大健康问题。

所有受试对象均知情并签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

1.2方法本研究采用聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法[9]分析GSTZ1 Lys 32 Glu的基因多态性。

1.2.1DNA的提取血液样品DNA通过北京天根公司血液基因组DNA提取试剂盒进行提取。①将-80 ℃冻存的抗凝血混匀，取300 μL放入1.5 mL离心管中，加入750 μL的细胞裂解液CL，颠倒混匀5次；②10 000 g离心1 min，弃上清，倒置于干净吸水纸上停留2 min；③向此管中加入缓冲液FG和蛋白酶K的混合液151.5 μL，立即漩涡至溶液无团块；56 ℃水浴10 min，其间颠倒混匀数次；④加入异丙醇150 μL，颠倒混匀，10 000 g离心3 min，弃上清，倒置于干净吸水纸上停留2 min；⑤加入70%乙醇150 μL，漩涡振荡5 s，10 000 g离心3 min，弃上清，倒置于干净吸水纸上停留5 min，空气干燥5 min；⑥加入洗脱缓冲液TB 200 μL，低速漩涡5 s，65 ℃水浴1 h，其间颠倒混匀数次助溶。最后保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2PCR扩增①设计引物(由上海生物工程技术有限公司合成):上游引物为，5′-TGACCACCCAGAAGTGTTAG-3′，下游引物为5′-AGTCCACAAGACACAGGTTC-3′。②PCR扩增体系：总体积20 μL,体系终浓度1×PCR 缓冲液,0.2 mmol/L dNTP,引物各300 pmol/ L,模板DNA(25~50 ng),TaqDNA 聚合酶0.5 U。③PCR反应条件:预变性95 ℃ 2 min,95 ℃变性20 s,65 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环,最后72 ℃延伸3 min。

1.2.3PCR扩增产物鉴定取5 μL PCR反应产物加样于3%琼脂糖(1 μL Goldview Ⅰ型核酸染色剂)上，100 V电压条件下，电泳40 min之后，用全自动凝胶成像分析系统扫描，目的条带于310 bp处显影。

1.2.4限制性片段长度多态性分析酶切反应总体积为20 μL，含10 μL PCR反应产物、10 U的限制性核酸内切酶Alw 26I、2 μL 10 ×buffer、7.6 μL超纯去离子水。以双蒸水代酶作为阴性对照，37 ℃酶切16 h。取酶切产物5 μL，加样于3%琼脂糖凝胶上，100 V电压电泳40 min，再用全自动凝胶成像分析系统扫描。

1.2.5限制性片段长度多态性分析扩增产物经Alw26I酶酶切以后，电泳可见到185 bp、125 bp 2条条带，即为AA基因型；若酶切后，产生159 bp、125 bp和26 bp 3条条带，即为GG基因型；若酶切后，产生185 bp、159 bp、125 bp和26 bp 4条条带，即为AG基因型。随机从每种基因型PCR扩增产物中选取5个，进行核苷酸序列测定，其结果均与本实验相同(图1)。

图1GSTZ1 Lys32Glu扩增后酶切结果

M.核酸分子标准；1、4、5.AG基因型；2.AA基因型；3.GG基因型(26 bp显示欠清)

Figure 1GSTZ1 Lys32Glu enzyme digestion results after amplification

1.3统计学方法应用SPSS 19.0 统计软件分析数据，组间基因型和等位基因频率比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1GSTZ1 Lys32Glu基因Hardy-Weinberg 遗传平衡检验经Hardy-Weinberg 遗传平衡检验(χ2=0.169，P=0.919)，说明符合此定律，提示该样本来自同一总体，具有代表性。

2.2伊朗、澳大利亚、德国、美国人群与河北汉族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型和等位基因分布频率的比较伊朗人群、澳大利亚人群、德国人群、美国人群与河北汉族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型和等位基因分布频率差异有统计学意义(P<0.05)。澳大利亚人群、德国人群、美国人群与伊朗人群差异有统计学意义(P<0.05)，而澳大利亚人群、德国人群、美国人群之间差异无统计学意义(P>0.05)。

在不同国家人群GSTZ1 Lys32Glu基因型频率分布构成比中，河北汉族人群中AA基因型所占比例最高(23.33%)，明显高于其他人群；GG基因型所占比例最低(24.77%)，明显低于其他人群。在伊朗人群中，AA基因型所占比例最低(5.13%)，GG基因型所占比例是AA基因型的12.5倍(64.10%vs5.13%)。澳大利亚、德国和美国人群中AA基因型相对较少，AG和GG基因型所占比例基本相当。 在等位基因分布构成比中：河北汉族人群的A与G等位基因所占比例基本相等(49.29%vs50.71%)，而伊朗、澳大利亚、德国和美国人群G等位基因所占比率明显高于A等位基因。见表1。

表1不同国家人群GSTZ1 Lys32Glu基因型分布的比较

Table 1　The comparisons of distributions of both genotype frequency and allele

*P<0.05与河北汉族人群比较#P<0.05与伊朗人群比较(χ2检验)

3讨论

谷胱甘肽硫-转移酶Zeta家族，是近来通过生物信息学方法和利用人类表达序列标签数据库发现的GST家族中的一种。存在于肝脏和其他组织的细胞质和线粒体基质中[10]。目前研究表明能够编码GST的基因分别分布在至少7 条不同染色体上，构成了一个超基因家族，编码具有GST活性的蛋白。GSTZ1属于其中一种，基因存在2种多态性，即DNA 序列94 和124 处的变化，从而分别导致Lys-32→ Glu 及Arg-42→Gly 的替代[4，9，11]。关于GSTZ1 Lys32Glu基因多态性与疾病易感性的研究国外已有许多报道，如Karaka-Celik 等[12]报道GSTZ1基因多态性和患胃癌的风险无关联。Saadat 等[13]研究表明GSTZ1 Lys32Glu基因多态性与先兆子痫无关，而GSTZ1 Arg42Gly基因多态性等位基因变化可降低患先兆子痫的风险。Rezaei等[14]研究表明，在早发双相情感障碍型患者中，Glu32Lys和G-1002A的变异等位基因会增加患病的易感性。本研究主要研究河北汉族人群GSTZ1 Lys32Glu基因多态性的分布，为以后与疾病相关性研究做准备。

本研究结果显示GSTZ1 Lys32Glu的基因多态性在地域和人种中的分布明显不同。河北汉族人群GSTZ1 Lys32Glu的基因存在多态性，符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律，具有代表性。河北汉族人群GSTZ1 Lys32Glu基因型频率分布和等位基因频率分布与伊朗人群、澳大利亚人群、德国人群、美国人群明显不同[14-17]。河北汉族人群中A等位基因占49.30%，明显高于其他人群。Nafissi 等[18]研究发现中国人A等位基因占48.9%，本研究结果与其高度一致。我国人口众多，多民族大聚集，基因多态性与民族及区域环境相关，所以其他省份和民族是否存在GSTZ1 Lys32Glu基因型频率分布和等位基因频率的差异，还需进一步研究。A等位基因在中国人中高表达，是否会造成其下游编码蛋白的活性下降，增加患遗传性酪氨酸血症的风险，还需扩大样本量和多中心研究证实。本研究发现河北人群与其他人群不同，考虑人种和地域不同所致。伊朗人群A等位基因占20.5%，明显低于中国河北汉族人群和澳大利亚、德国和美国人群，伊朗地处欧亚、印度洋与阿拉伯三大板块交界处，环境特殊；伊朗人与中国汉族人和欧美人群明显不同，其GSTZ1 Lys32Glu基因的多态性，考虑可能与人种和环境有关，当然还需其他研究支持。本研究结果显示，澳大利亚人群、德国人群、美国人群在GSTZ1 Lys32Glu基因型频率分布和等位基因频率分布差异无统计学意义。考虑三者人种相同，有相同遗传背景，环境因素对基因多态性影响不大。本研究可以为人种起源提供一定依据。当然，GSTs属一个超家族，其他亚基因型是否也存在类似的不同，还需更多研究证实。

[参考文献]

[1]Fedets OM. Structure and functions of glutathione transferases[J]. Ukr Biochem J,2014,86(3):23-32.

[2]宗晨,向卉芬,陈大蔚,等.谷胱甘肽S-转移酶基因与复发性流产[J/CD].中华临床医师杂志:电子版,2013,7(23):10979-10981.

[3]Klusek J,Gluszek S,Klusek J. GST gene polymorphisms and the risk of colorectal cancer development[J]. Contemp Oncol(Pozn),2014,18(4):219-221.

[4]高雅琼,王彩丽.谷胱甘肽硫转移酶基因多态性与疾病关系的研究进展[J].医学综述,2013,19(1):29-31.

[5]Wang D,Zhai JX,Zhang LM,et al. Null genotype of GSTT1 contributes to increased Parkinson's disease risk in Caucasians:evidence from a meta-analysis[J]. Mol Boil Rep,2014,41(11):7423-7430.

[6]Mazzetti AP,Fiorile MC,Primavera A,et al. Glutathione transferases and neurodegenerative diseases[J]. Neurochem Int,2015,82:10-18.

[7]Mikstacki A,Zakerska-Banaszak O,Skrzypczak-Zielinska M,et al. Glutathione S-transferase as a toxicity indicator in general anesthesia:genetics and biochemical function[J]. J Clin Anesth， 2015,27(1):73-79.

[8]Saadat I,Khalili M,Nafissi S,et al. Susceptibility to breast cancer and three polymorphisms of GSTZ1[J]. DNA Cell Biol， 2012,31(3):337-341.

[9]Blackburn AC,Tzeng HF,Anders MW,et al. Discovery of a functional polymorphism in human glutathione transferase zeta by expressed sequence tagdatabase analysis[J]. Pharmacogenetics,2000,10(1):49-57.

[10]Boone CD,Zhong G,Smeltz M,et al. Preliminary X-ray crystallographic analysis of glutathione transferase zeta 1(GSTZ1a-1a)[J]. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun,2014,70(Pt 2):187-189.

[11]常彬霞,貌盼勇,白冰珂,等.谷胱甘肽S转移酶的研究进展及其与肿瘤的相关性[J].解放军医学杂志,2012,37(8):838-842.

[12]Karakas-Celik S,Aras N,Ates C. Glutathione S-transferase Z1(GSTZ1) gene polymorphism in gastric cancer:a preliminary study in a Turkish population[J]. Lab Med,2014,45(1):37-42.

[13]Saadat M,Anvar Z,Namavar-Jahromi B,et al. Genetic polymorphisms of glutathione S-transferase Z1(GSTZ1) and susceptibility to preeclampsia[J]. Mol Biology Rep,2012,39(9):8995-8998.

[14]Rezaei Z,Saadat I,Saadat M. Association between three genetic polymorphisms of glutathione S-transferase Z1 (GSTZ1) and susceptibility to bipolar disorder[J]. Psychiatry Res,2012,198(1):166-168.

[15]Menegon A,Board PG,Blackburn AC,et al. Parkinson's disease,pesticides,and glutathione transferase polymorphisms[J]. Lancet,1998,352(9137):1344-1346.

[16]Andonova IE,Justenhoven C,Winter S,et al. No evidence for glutathione S-transferases GSTA2,GSTM2,GSTO1,GSTO2,and GSTZ1 in breast cancer risk[J]. Breast Cancer Res Treat,2010,121 (2):497-502.

[17]Lesseur C,Gilbert-Diamond D,Andrew AS,et al. A case-control study of polymorphisms in xenobiotic and arsenic metabolism genes and arsenic-related bladder cancer in New Hampshire[J]. Toxicol Lett,2012,210(1):100-106.

[18]Nafissi S,Saadat I,Saadat M. Genetic polymorphisms of glutathione S-transferase Z1 in an Iranian population[J]. Mol Biol Rep,2011,38(5):3391-3394.

(本文编辑：许卓文)

Genetic polymorphism of glutathione S-transferase zeta1 among healthy Han population in Hebei province

FAN Zhi-liang1，2，FENG Xiao-juan3，LI Chun-yan2，

YIN Shao-hua1，TIAN Xin-ying2*，REN Wen-bo4

(1.Department of Neurology Ⅲ,the People′s Hospital of Xingtai City,Hebei Province,Xingtai

054001,China;2.Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University，

Hebei Province,Shijiazhuang 050000,China;3.Department of Ultrasound,the People's

Hospital of Xingtai City,Hebei Province,Xingtai 054001,China;4.Department of

Neurology,the Fifth Central Hospital of Tianjin,Tianjin 300000,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the glutathione S-transferase zeta 1(GSTZ1)genetic polymorphisms among healthy Han population of Hebei province.MethodsUsing polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) to detect the genotypes of GSTZ1 Lys32Glu in 210 healthy Han population of Hebei province.ResultsThe genotype distribution of the healthy Hebei Han population is consistent with Hardy-Weinberg genetic equilibrium law.The distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu in Hebei healthy Han population are significantly different from those in Iranian,Australian,German and American(P<0.05). The distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu in Iranian are significantly different from those in Australian,German and American(P<0.05), however,there are no significant difference among Australian,German and American in the distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu(P>0.05). ConclusionThe distributions of both genotype frequency and allele frequency of GSTZ1 Lys32Glu in Hebei healthy Han population own its characters.The distributions of GSTZ1 Lys32Glu in regions and races are significantly different.

[Key words]gene;polymorphism;glutathione S-transferase zeta 1;Hebei Han population

[中图分类号]R394.3

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)02-0133-04

通讯作者*。E-mail：txyhb@126.com

[作者简介]范志亮(1982-)，男，河北邢台人，河北省邢台市人

[基金项目]邢台市科学技术研究与发展计划(2013ZC171)

[收稿日期]2015-05-13；[修回日期]2015-06-04