ATP生物发光法在快速检测物体表面清洁度中的应用

刘 阳,牟金明

(吉林农业大学农学院，吉林长春 130000)



ATP生物发光法在快速检测物体表面清洁度中的应用

刘 阳,牟金明*

(吉林农业大学农学院，吉林长春 130000)

细菌总数检测是食品卫生学领域的重要检测指标，主要是用来判断食品等被污染的程度。对细菌总数进行快速准确地检测一直是该领域内重要的研究课题。对细菌总数进行检测的国标方法是平板计数法[1]，该方法测试时间长，操作繁琐，不适合现场检测。检测的时效性在食品等行业尤为重要，在加工过程中实时的监控生产环境更是防患于未然的根本方法，显然这是国标法无法做到的。ATP生物发光微生物检测技术是一种以生物发光反应为基础的快速检测技术[2]，此技术用生物发光法测定细菌体中ATP的含量，再利用细菌体ATP含量与菌落总数成正比这一原理，推算出菌落总数[3]。与传统的细菌总数国标平板计数法相比，ATP生物发光微生物检测技术具有操作简便、快速灵敏、成本低廉、绿色环保等优点。利用ATP发光法实时检测细菌总数可以很好地弥补国标法的不足，两者相互辅助，相得益彰。近几年，在我国ATP发光法也得到了广泛的应用。笔者以ATP生物发光微生物检测技术为指导，通过提取重组的萤火虫荧光素酶，配制完成一体化的荧光反应试剂并研究其在物体表面清洁度快速检测方面中的应用。

1材料与方法

1.1材料试验中所用到的氯化钠(NaCl)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritionX-100)等生化试剂均为国产分析纯，广东华大技术有限公司；0.4 μm的硝酸纤维素膜，美国Millipore公司；蛋白纯化所用仪器为液相色谱系统AKTA PURIFIER，美国GE公司；检测荧光强度仪器为BHP9505微量光度计，北京滨松光子技术有限公司。

1.2试剂制备

1.2.1ATP标准溶液的配制。用分析天平称取0.010 1 g ATP白色粉末溶于20 mL灭菌的双蒸水中，配制成1 mmol/L的标准ATP母液，分装到2 mL无菌EP管中，放入-80 ℃冰箱冷冻保存备用。使用时稀释即得到浓度为10 μmol/L的ATP标准溶液。

1.2.2一体化荧光反应试剂的制备(终浓度)。Tris-HCl pH 7.8 50 mmol/L；KCl 100 mmol/L；MgCl22 mmol/L；丙三醇(glyercol)10%；聚乙二醇辛基苯基醚(TritionX-100)1%。

1.2.3PBS缓冲液的配制。pH 7.8 的0.2 mol/L NaH2PO48.5 mL与0.2 mol/L Na2HPO491.5 mL混合。

I=Imax×cATP/Km+cATP

式中，Imax为最大发光强度；Km为1×10-4。由上式可知，当cATP远小于Km时，I正比于样品中的cATP。因此可通过测定发光体系的I值来定量ATP浓度[5]。

正常条件下细菌体内的ATP含量趋近恒定，为10-18mol[6]。以光电倍增管为核心采光部件的光度计都能检测低于 10 pg分子的ATP，这就使快速、准确检测细菌成为可能。

1.4蛋白纯化萤火虫荧光素酶质粒由美国Cellex公司 CEO James惠赠，该质粒载体为pET15b-sumo 。将该质粒转化到感受态细胞为BL21DE3中37 ℃培养16 h，从含AMP(氨苄西林)100 μg/mL的平皿中挑取单克隆到5 mL的 LB培养基中(AMP 50 μg/mL)，37 ℃摇动培养5 h，按接种比例1∶1 000将前培养样品转接到3 L 的LB 培养基中(AMP 50 μg/mL)37 ℃摇动培养，直至OD值到 0.6～0.7，加入0.3 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖(ITPG)后，改成18 ℃摇动培养16 h。4 000 r/min、30 min、4 ℃低温离心收集发酵细菌，细菌超声波破碎后，12 000 r/min、4 ℃低温离心30 min，取上清液。将上清液用0.45 μm一次性硝酸纤维素滤膜过滤后通过Ni-NTA(GE Healthcare)初步纯化，洗脱的样品再次通过阳离子sp(GE Healthcare)纯化得到重组的萤火虫荧光素酶，将得到的样品加入10% 甘油冻存在-80 ℃冰箱中保存备用。

1.5试验方法

1.5.1ATP标准曲线的建立。 用双蒸水将浓度为10 μmol/L的ATP标准溶液，按1∶10梯度比例稀释成1 μmol/L 、100 nmol/L、10 nmol/L 、1 nmol/L、 100 pmol/L、10 pmol/L系列溶液(注意：ATP溶液极易降解，稀释好的溶液应放在冰上)。用微量移液器吸取50 μL荧光反应试剂(Tris-HCl pH 7.8 50 mmol/L；KCl 100 mmol/L；MgCl22 mmol/L ；glyercol 10%)，加入荧光反应比色杯中，然后分别加入5 μL稀释后的各梯度ATP溶液，用微量光度计检测相对荧光值(RLU)，重复上述步骤。

1.5.2细菌总数标准曲线的建立。 将从冰箱中取出的大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌3种细菌分别在LB培养基中复苏培养6 h，将3种不同浓度的菌液按1∶1∶1比例进行混合摇匀后备用。用无菌的PBS缓冲液将混合菌液连续10倍稀释，稀释至可以得到单菌落的浓度梯度(10-7～10-9)为止，用倾注平板法将营养琼脂培养基注入1 mL稀释的混合菌液，每个稀释梯度做2个平行试验，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，对平板上形成的单菌落进行计数，单位用CFU/mL表示(平皿计数法参见国标，GB4789. 2-2010)。同时检测相对应梯度菌液的相对荧光值(RLU)，即用移液枪吸取混合稀释好的菌液10 μL加入配制好的一体化荧光反应试剂50 μL，轻轻吸打混匀，推入至微量光度计检测管内读取相对荧光值(RLU)，每个梯度测2次，取平均值计数。分别以相对荧光值对数值即lg(RLU)和菌落总数对数值lg(CFU/mL)为横坐标和纵坐标作图。

1.5.3物体表面细菌总数检测及标准曲线的建立。 取无菌棉签，将棉签头部放入无菌的装有2 mL PBS缓冲液的EP管中浸湿，然后用此棉签在被测物体表面均匀涂擦，并随之转动棉签，采样总面积为10×10 cm2。将取完样的棉签头部再次放入到原EP管中涡旋摇晃洗涤数次，即得到物体表面菌样。将得到的菌样进行菌落总数和相对荧光值检测(方法同“1.5.2”)。分别以相对荧光值对数值lg(RLU)和物表菌落总数对数值lg(CFU/mL)为横坐标和纵坐标作图。

2结果与分析

2.1重组萤火虫荧光素酶检测ATP活力 萤火虫荧光素酶分子量为60 kD，pET-sumo载体含有20 kD的sumo标签蛋白，野生型的萤火虫荧光素酶经过发酵诱导后大多在包涵体里，几乎没有可溶性的目的蛋白。为此在构建时加入sumo促溶标签共同表达，以增加该蛋白的可溶性，在试验的过程中，如果用sumo酶(promega)进行标签切除，蛋白变得极不稳定，出现大量沉淀，所以最终得到的蛋白是含有20 kD sumo标签的重组蛋白，见图1。为检验重组蛋白是否仍具有良好的活力，试验分别以相对发光值对数值lg(RLU)和ATP浓度值lg[ATP]为横坐标和纵坐标作图。图2 表明，在ATP浓度为10 pmol/L～10 μmol/L范围内，ATP浓度与相对荧光值(RLU)呈较好的线性关系，相关性R2=0.986 9。

图1　重组萤火虫荧光素酶SDS-PAGE 10%Fig.1　Recombinant firefly luciferase SDS-PAGE 10%

图2　ATP生物发光法标准曲线Fig.2　Standard curve of the ATP bioluminescent method

2.2ATP生物发光法检测结果与细菌总数的相关性在马妮等的研究中，利用ATP发光法检测细菌总数至少需要2步，首先要加入裂解液去释放细菌中的ATP，再加入发光反应试剂与菌体释放出的ATP反应检测光值[7]。因为该发光反应极其灵敏，并且生活中遍布着大量游离的ATP，使得每多加一步反应过程都会增加污染的可能。笔者在试验的过程中尝试了多种去污剂，最后筛选出既可以快速裂解细菌又不会影响发光的非离子型表面活性剂TritionX-100[8]。

图3试验结果表明，加入TritionX-100的反应试剂，不仅得到了相对荧光值与菌落总数良好的线性关系，而且也完成了裂解与发光反应的一体化试剂。以此构建数学模型，重新做10组试验，方法同“1.5.2”，将得到的RLU值代入到y=1.708 8x-1.942 5中，算出y转换成菌落总数预测值。预测值与平板计数法得到的菌落总数值实际值结果见表1。将表1中的菌落总数预测值与实际值进行相关性分析得到表2。结果表明，菌落总数实际值与菌落总数预测值相关性系数r=1.000，呈极显著正相关(P<0.01)，即ATP生物发光法检测混合菌液菌落总数与国标平板计数法检测结果基本一致。

2.3ATP生物发光法快速检测物体表面细菌总数对4种表面大小为10×10 cm2的不同样品物体清洗前后进行ATP生物发光法对比检测，试验结果见表3。说明应用ATP生物发光法检测物体表面清洗前后相对荧光值差异显著，在实际检测中可以快速地定性判断物体表面的清洁程度。

图3　ATP生物发光法细菌总数标准曲线Fig.3　Standard curve of total bacterial count in ATP bioluminescent method

序号No.相对荧光值(RLU)Relativelightunit相对荧光值对数lg(RLU)XLogarithmvalueofrelativelightunit菌落总数预测值对数lg(CFU)YLogarithmvalueofthepredictedvalueoftotalbacterialcount菌落总数预测值Predictedvalueoftotalbacterialcount∥CFU/mL菌落总数实际值Actualvalueoftotalbacterialcount∥CFU/mL19722.9876662.98766615003200212513.0972573.09725722003200338743.5881603.5881601500020000454183.7338393.733839270000320000586433.9366653.9366656100007000006126304.1014034.101403120000018000007354194.5492364.549236680000072000008495524.6950614.69506112000000200000009745084.8722034.8722032400000020000000105224905.7180785.718078670000000700000000

表2混合菌液菌落总数预测值与实际值相关性分析

Table 2Correlation analysis of the actual and predicted values of the mixed bacteria

项目Item相关Correlation菌落总数预测值Predictedvalueoftotalbacterialcount菌落总数实际值Actualvalueoftotalbacterialcount菌落总数预测值Pearson相关性11.000**Predictedvalueoftotal显著性(单侧)0.000bacterialcountN1010菌落总数实际值Pearson相关性1.000**1Actualvalueoftotal显著性(单侧)0.000bacterialcountN1010

注：**表示极显著相关。

Note： ** indicated extremely significant correlation.

表3不同种类的同一物体表面清洗前后检测相对荧光值(RLU)结果对比

Table 3Comparison of relative light units(RLU)of the same object surface before and after cleaning

检测项目Detectionitem清洗前(RLU)Beforecleaning自来水(RLU)Runningwater酒精消毒(RLU)Alcoholsterilization刀Knife63516218案板Choppingboard83929721手Hand3890806102办公桌Officetable1598293236

图4　ATP生物发光法检测不同餐盘表面菌落总数标准曲线Fig.4　Standard curve of total bacterial count in different plate surfaces by ATP bioluminescent microbial detection

进一步对食堂的130个不同餐盘表面进行菌落总数和相对荧光值同步检测，方法同“1.5.3”。图4将2组数据进行线性拟合得到良好的线性关系。同样以此标准曲线为数学模型，重新检测食堂10个不同餐盘的表面，将得到的RLU值代入到公式y=0.992x+0.367 4中，得到y换算成菌落总数预测值，预测值与平板计数法得到的菌落总数实际值结果见表4。将表4中菌落总数的预测值和实际值进行相关性分析得到表5。结果表明，ATP生物发光法测定的盘子物体表面菌落总数实际值和菌落总数预测值相关性系数r=0.998，呈极显著的正相关(P<0.01)。即ATP生物发光法检测物体表面的结果与国标平板计数法基本一致，可用此法进行物体表面清洁度的快速检测。

表4　10组餐盘表面菌落总数的预测值与实际值

表5　不同餐盘表面菌落总数的预测值与实际值相关性分析

注：**表示极显著相关。

Note： ** indicated extremely significant correlation.

3结论与讨论

3.1结论该研究建立的ATP生物发光微生物检测技术检测的相对荧光值与物体表面的菌落总数存在良好的线性相关性，且ATP生物发光法操作简便、快速灵敏、成本低廉、绿色环保，可快速、准确地检测物体表面清洁度。

3.2讨论

3.2.1建立食品及服务等行业的半定量标准。ATP发光法实时检测细菌总数应用广泛，在生产设施清洁、消毒效果检测，原、辅料细菌总数检测，生产设备关键控制点(例如供水、通风阀门)、卫生学监测，化妆品及乳品微生物总数检测中都可以起到很好的实时监控的作用，但是目前只能作为企业内部生产环节控制的辅助手段。统计结果证实，凡ATP荧光法显示卫生水平有所改善，则对应的平皿计数细菌总数也会显著减少；如果检测点ATP检测结果偏高，24 h后必然大量滋生细菌导致严重污染。如能通过国标法和ATP荧光法两者之间建立起符合食品安全卫生标准的有效范围(如合格、警告、不合格)；将会大大增加食品企业的产品合格率。

3.2.2ATP发光法实时检测细菌的不足。 ATP发光法最大的优势就是检测过程快速，且灵敏度极高，但该方法在不同的大环境下容易受到影响，不同的食品企业会在食品中加入种类繁多的添加剂，其中有些会影响到光值的稳定性，这种特性就制约着ATP发光法检测细菌的普遍性，使得该检测方法还没能进入国家标准检测方案，所以目前只能是企业内部建立自我卫生监控，还无法成为国家卫生执法部门统一有效的检测手段。ATP发光法检测细菌的快速、便捷是显而易见的，如何克服该方法的不足将是今后努力的目标。

参考文献

[1] GRACIAS K S，MCKILLIP J L.A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food[J].Microbiology，2004，50(11):883-890．

[2] FORD S R，LEACH F R.Improvements in the application of firefly luciferase assays[J].Methods in molecular biology，1998，102：1-20.

[3] 连英姿，董雪，李勇，等.ATP生物发光技术快速检测水中细菌的研究[J].中国卫生检验杂，2007，17(10)：1859-1860.

[4] 唐倩倩，叶尊忠，王剑平，等.ATP生物发光法在微生物检验中的应用[J].食品科学，2008，29(6)： 460-464.

[5] 吴巨贤，石晓艳，王焰红，等.ATP荧光传感器在食品中的应用[J].食品研究与开发,2011，32(5)：171-173.

[6] 李利霞，伍金娥，常超，等.优化的ATP生物发光法快速检测面粉中细菌总数[J].安徽农业科学，2011，39(7)：4055-4057.

[7] 马妮，赵红，张旭，等.ATP发光技术快速检测食品中菌落总数[J].中国卫生工程学，2008，7(5)：296-297.

[8] ISHIDA A，YOSHIKAWA T，NAKAZAWA T，et al.Enhanced firefly bioluminescence assay of ATP in the presence of ATP[J].Analytical biochemistry，2002，305： 236-241.

摘要[目的]建立一种快速、准确检测物体表面清洁度的方法。[方法]以ATP生物发光微生物检测技术为指导，提取重组的萤火虫荧光素酶并配制成荧光反应试剂，测定其与ATP发光反应值的线性关系；根据ATP含量与细菌数量成正比例关系原理, 测定物体表面ATP发光强度值，同时用国标平皿计数法测定其菌落总数，两者对比分析。[结果] ATP生物发光法检测的相对荧光值与物体表面的菌落总数存在良好的线性相关性，利用ATP发光法实时检测细菌总数可以很好地弥补国标法的不足。[结论] ATP生物发光法与传统的细菌总数国标平板计数法相比较具有操作简便、快速灵敏、成本低廉、绿色环保等优点，可以快速、准确地检测物体表面清洁程度。

关键词ATP生物发光法；菌落总数；物体表面；清洁度

Application of ATP Bioluminescent Method in Rapid Detection of Object Surface Cleanliness

LIU Yang, MU Jin-ming*(College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130000)

Abstract[Objective] To establish a rapid and accurate detection method for object surface cleanliness. [Method] With ATP bioluminescent microbial detection technology as the guidance, recombinant firefly luciferase was extracted in order to prepare fluorescence reaction reagent. Its linear relation with ATP response value was detected. According to the principal of positive correlation between ATP content and bacterial population, ATP luminous intensity of object surface was detected. Total bacterial count was calculated by national standard plate counting method. And comparative analysis was carried out. [Result] There was good linear relationship between relative fluorescence unit and total bacterial count of object surface. Real-time detection of total bacteria by ATP bioluminescent method could make up for the disadvantages of national standard. [Conclusion] Compared with traditional national standard plate counting method, ATP bioluminescent microbial detection technology is more simple, rapid, sensitive and cheap. And it can rapidly and accurately detect the cleanliness of object surface.

Key wordsATP bioluminescent method; Total bacterial count; Object surface; Cleanliness

收稿日期2015-12-04

作者简介刘阳(1987-)，女，辽宁丹东人，硕士，从事农田生态与作物种植规划研究。*通讯作者，副教授，博士，从事农田生态与作物种植规划研究。

中图分类号TS 207.4

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)01-125-04