一类申报新药雷腾舒工作对照品核磁共振定量分析方法的建立

贾国慧++呼海涛

摘要 目的：建立一类申报新药雷腾舒工作对照品的核磁共振定量方法。方法：以咖啡因为内标，采用核磁共振定量法对雷腾舒样品进行定量。结果：本方法三个不同浓度水平的样品平均回收率为99.87%，RSD0.76%。重复性考察RSD为0.53%。日间精密度考察RSD为0.20%。结论：所建立的核磁共振定量方法，简便、快速、准确性、重复性好，可作为该新药工作对照品定量的方法之一。

关键词 核磁共振定量法 雷腾舒 工作对照品赋值

中图分类号：TQ460.72； 0657.2

文献标识码：A

文章编号：1006-1533（2016）01-0072-03

随着我国新药研究的发展，企业研发人员需要为开发的新药制备工作对照品并进行定量的情况越来越多。为确保定量的可靠性，往往需要用多种不同原理来建立定量方法。通过不同方法所测数据的差异，对工作对照品定量的准确性与可靠性进行确认。常用的方法丰要包括色谱扣除法（质量平衡法）和容量分析方法等，然而对于有些没什么滴定活性基团的化合物，往往很难找到合适的容量分析方法。

本研究为拟申报化学11类新药雷腾舒（研发代号T8，目前已在II期临床评价阶段，图1）药学研究中的一部分，按照新药研究指导原则，须采用不同原理的方法对其工作对照品进行定量（赋值）研究。在我们完成质量平衡法评估后，希望采用经典的容量分析方法进行比对研究。然而通过对本品结构、性质的深入分析，发现其结构中存在的3类可能的可滴定基团（环氧基、羟基、内酯环）都很难设计量化方案。分析如下。

①环氧基结构中存在的三个环氧结构单元，各自的化学环境不尽相同，难以量化反应程度。②羟基结构中有两个羟基，一个为二级羟基、另一个为三级羟基。二级羟基虽可通过与醋酐反应酰化后，用碱滴定牛成的醋酸，从而完成定量，但前提是须确保酰化完全。即使可以酰化完全，醋酐也很容易使三级羟基脱水，从而干扰定量结果。③内酯环该基团理论上可与碱反应，先加成再脱去-OR，但因本品内酯环上同时存在双键，会导致1、2加成与l、4加成同时存在，很难量化。预试验结果也证实了上述分析。

面对上述问题，如何选择更加便捷、可靠的赋值方法成为我们在新药申报中必须考虑的问题。通过调研，我们发现采用已知含量的其他化合物做内标的定量核磁方法可以很好地解决我们所面临的问题。方法具有专属性好、无需已知含量自身对照品的技术特点。

为了建立并验证该方法在新药一雷滕舒样品定量上的可行性，我们对该方法进行了研究，并获得了准确性、重复性良好的结果。

1 材料与方法

1.1 仪器

核磁共振仪（德国布鲁克，Ascend 400）。天平（瑞士梅特勒，XP56，百万分之一）。

1.2 试药

雷腾舒（本公司自制，批号：235-61、20080102）；咖啡因（Alfa公司，含量99.6%）；氘代乙腈、氘代吡啶（J&K Scientific Ltd.）；氘代二甲亚砜（Cambridge Isotope Laboratories. Inc.）。

1.3 样品制备与计算

精密称定咖啡因（约4mg）及本品（约6mg）适量至2ml量瓶，以氘代乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，取约0.5ml到核磁管，上样测定。分别记录化学位移值为3.345、3.358组峰（T8）的面积和化学位移值为3.274峰（咖啡因）的峰面积，按下述公式计算。

A_{1/A2=n1W1/M1/（n2W2/M2）}

其中A_{1为T8定量峰的面积、A2为内标咖啡因定量峰的面积；}

n_{1为T8定量峰氢质子数（n1=1），n2为咖啡因定量峰氢质子数（n2=3）；}

W_{1为T8测定量，W2为咖啡因称样量，M1、M2分别为T8、咖啡因的分子量。}

1.4 核磁共振仪条件设置

核磁共振仪：2930序列，共振频率400兆赫，磁场强度9.4T，弛豫时间12s，中心频率3.31ppm。

2 结果

2.1 方法的重复性

采用本法对经干燥的T8样品（批号：235-61）平行测定5次，考察方法的重复性（表1）。结果表明，RSD小于2，方法重复性很好。

2.2 方法的重现性

为了考察方法的重现性，我们在不同日期，对上述T8样品进行了测定，经计算方法重现性好（表2）。

2.3 方法的准确度

采用上述方法，对方法准确度进行考察。取经干燥的T8原料（批号：235-61）4、6、8mg，精密称定，分别置于2ml量瓶中，再分别加入精密称定的4mg咖啡因，用氘代乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取0.5ml至核磁管中，测定。从平均回收率和RSD值可见该方法准确度非常好（表3）。

2.4 与质量平衡法数据的比较

采用本法和质量平衡法分别检测了批号为20080102的T8样品。本法测定结果：99.20%、质量平衡法测定结果：99.56%。两种方法测定结果基本一致。

3 讨论

工作对照品定量（赋值）是研发工作中经常遇到的问题。在追求真值的过程中，需要多种分析于段协同作用，综合判断。采用核磁共振仪进行定量，提供了不同原理定量的义一方法。该方法的定量研究，国内外已有报道，其工作原理也在多国药典上有详述，但在新药附值研究的实际应用方面报道不多。

我们在方法建立过程中发现，内标选择、样品前处理、仪器参数设置等因素，都会对检测结果产牛影响，须关注。

以本研究为例，我们筛选了多个化合物，最终选定了咖啡因（图1）作为内标物。因为咖啡因结构中氢的磁场环境比较简单，可找到与本研究被测物峰位不干扰且场位比较接近的测量峰；另外，经考察，咖啡因在我们选定的溶解样品的溶剂氘代乙腈中非常稳定而且不会与被测物反应。这些特点保障了测定结果的稳定性和重复性。

新药赋值研究中，节约样品和选择合适的溶解样品的溶剂也是我们方法设计中不得不考虑的问题。为筛选到样品溶解度高、稳定性好、且对测定无干扰的溶剂，我们分别考察了氘代二甲亚砜、氘代吡啶、氘代乙腈三种溶剂，结果发现，氘代二甲亚砜为溶剂，虽然可满足溶解度高、溶剂干扰少、样品稳定性好等要求，但重复性、线性结果不稳定，无法达到预期的定量要求。经分析发现，为节省样品与氘代试剂，我们在试验方案中选用了1ml量瓶进行定容，由于氘代二甲亚砜黏度大，容易导致定量误差，使测定结果重现性不好。为此，我们换用氘代吡啶作为溶解溶剂对方法进行考察，发现T8在氘代吡啶中不稳定，放置后溶液颜色会发牛变化，测定结果可靠性差。通过这两次溶解溶剂对测定结果的影响，我们重新分析了T8的溶解度、稳定性，最终选择氘代乙腈为溶剂，获得了比较理想的结果。

此外，仪器的参数设置，也是影响数据稳定性的重要因素，特别是中心频率、弛豫时间、扫描次数的设定。合适的中心频率（参数OI）的选择，可使脉冲对各定量峰强度的影响差异最小。另外，须考察弛豫时间、扫描次数对外加标准和待测物响应稳定性的影响，以确定最佳参数。

综上，在新药开发过程中无法获得标准品对照的情况下，采用核磁定量法对企业自制工作对照品进行纯度分析与赋值，是不同原理进行纯度评估的新选择。其优点除简单、快捷之外，还具有不需要已知含量待测样品的对照品，仅需要已知含量的普通化学品的特点。这很好地解决了新药工作对照品赋值研究中无对照品的问题，且测定数据可靠性好。