前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因rs529787位点多态性与血脂和缺血性脑卒中的关系研究

张艳，韩登峰，张小宁

前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因rs529787位点多态性与血脂和缺血性脑卒中的关系研究

张艳，韩登峰，张小宁

目的探讨前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）基因rs529787位点多态性与脂代谢和缺血性脑卒中（IS）的关系。方法选取2012年7月—2015年7月到新疆医科大学第一附属医院神经内科就诊的IS患者414例为病例组，另选取同时期在本院进行体检的健康成年人350例为对照组。比较并分析两组的临床资料、基因型和等位基因分布情况。结果两组性别、年龄、民族、吸烟史、饮酒史、总胆固醇（TC）、载脂蛋白A1（APOA1）及载脂蛋白B（APOB）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组高血压和糖尿病合并情况、收缩压、舒张压、空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）及脂蛋白（a）〔Lp（a）〕比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组基因型分布比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组等位基因分布比较，差异亦有统计学意义〔OR（95%CI）＝1.763（1.038，2.994），P＜0.05〕。对照组中，不同基因型受试者的TC、TG、LDL-C、HDL-C、APOA1、APOB及Lp（a）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。病例组中，不同基因型患者的TG、LDL-C比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而TC、HDL-C、APOA1、APOB及Lp（a）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。多因素非条件Logistic回归分析显示，高血压合并情况、收缩压、FPG、TG、LDL-C、HDL-C对IS的影响有统计学意义（P＜0.05）。结论PCSK9基因rs529787位点为CC基因型的IS患者血清TG和LDL-C水平较低，TG、LDL-C及HDL-C是IS的影响因素，携带等位基因C可能是IS的易患因素。

卒中；基因多态性；前蛋白转化酶枯草溶菌素9；血脂异常

张艳，韩登峰，张小宁.前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因rs529787位点多态性与血脂和缺血性脑卒中的关系研究［J］.中国全科医学，2016，19（7）：803－807.［www.chinagp.net］

Zhang Y，Han DF，Zhang XN.Correlation between PCSK9 gene rs529787 polymorphism and blood lipid and ischemic stroke［J］.Chinese General Practice，2016，19（7）：803－807.

缺血性脑卒中（IS）是由多种原因引起的脑部血液供应障碍，可出现脑组织缺血、低氧性坏死，导致相应神经功能损伤。IS是一种受遗传、环境等影响的多因素、多基因疾病，基本病理基础为动脉粥样硬化，而血脂是动脉粥样硬化的关键因素［1］。近年研究显示，血脂异常与基因多态性调控有关，特别是前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）基因的相关位点与脂代谢和IS均有直接相关性［2］。PCSK9分泌入血后与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDLR）发生特异性结合，形成的复合物进入细胞后可到达溶酶体并降解，从而增加低密度脂蛋白（LDL）水平，而LDL是导致动脉粥样硬化的首要血浆脂蛋白［3］。目前，国内外关于PCSK9基因水平的研究较多，且其在冠心病领域的作用已得到证实，但其与脑血管疾病的相关性研究较少。本研究对IS患者和健康体检者的PCSK9基因rs529787位点进行比较和分析，旨在探讨该位点多态性与血脂和IS的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012年7月—2015年7月到新疆医科大学第一附属医院神经内科就诊的IS患者414例为病例组，均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》［4］中的诊断标准。纳入标准：（1）均有急性神经功能缺失症状，且持续24 h以上；（2）经颅脑MRI或头颈部CT血管造影术（CTA）、颅内多普勒检查等明确诊断为动脉粥样硬化性IS；（3）入院前2周内未服用过降脂类药物。排除标准：（1）伴短暂性脑缺血发作、脑栓塞等出／凝血功能异常；（2）伴动脉炎或其他原因引起的脑梗死；（3）合并冠心病、严重心／肝／肾功能不全、肿瘤及自身免疫系统疾病等。另选取同时期在本院进行体检的健康成年人350例为对照组，排除有脑卒中家族史、6个月内有创伤手术史及3个月内有感染性疾病史者。本研究通过了新疆医科大学医学研究伦理委员会的批准，研究前受试者或其家属均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集 通过查阅电子病历和体检资料，收集两组的临床资料。包括：（1）基本情况，如性别、年龄、民族、吸烟史、饮酒史、血压及合并慢性病情况。以吸烟超过2年，吸烟量为3～40支／d为存在吸烟史；以饮酒超过1年，平均饮酒量＞1.3 g／d为存在饮酒史；主要调查慢性病为高血压和糖尿病。（2）血糖、血脂相关指标，包括空腹血糖（FPG）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、载脂蛋白A1（APOA1）、载脂蛋白B（APOB）及脂蛋白（a）〔Lp（a）〕。

1.2.2 标本采集 在受试者均知情同意的情况下，抽取6：00～8：00的空腹静脉血5 ml，置于含有2%乙二胺四乙酸（EDTA）的一次性试管中。常温下，以3 200 r／min离心10 min，离心半径为10 cm。分离血清和血细胞，立即置于－20℃冰箱中保存，以进行DNA提取和血浆、淋巴细胞分离，然后置于－80℃冰箱内长期保存备用。

1.2.3 基因型检测 采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司生产，溶液型）提取基因组DNA。采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR－RFLP）基因分析法检测PCSK9基因的rs529787位点多态性。根据hapmap数据库中中国北京（CHB）人群PCSK9基因信息作为tagSNP标准，查询文献和人类基因库进行检索，确定目的基因扩增引物序列，rs529787的上游引物：GCTGGGTGTGGAGAAAGGGTTT，下游引物：CCCTGAGGCACTGATGTGGAGT。PCR循环程序：96℃1 min；28×（96℃10 s，55℃5 s，60℃ 30 s）；4℃，延伸产物纯化，在10μl延伸产物中加入1 U虾碱性磷酸酶（SAP），37℃温浴1 h，然后75℃灭活15 min。延伸产物上ABI3730XL测序收集的原始数据用GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA）分析。若检测结果显示，只有一种碱基得到延伸，表现为相应单峰，则为纯合子；若两种碱基都得到延伸，表现为双峰，则为杂合子；经ABI公司生产的DNA测序仪检测后，可通过峰的颜色确定掺入的碱基种类，进而确定被测定样本基因型。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。根据公式计算各等位基因频率，根据Hardy－Weinberg公式计算各基因型（p＋q＝1，2pq＝杂合型基因频率）的理论值（野生型：样本总数×p2，杂合突变样本总数×2pq；纯合突变：样本总数×q2），采用χ2检验检测Hardy－Weinberg平衡吻合度，计算各组基因型频率及等位基因频率。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；等位基因频率组间比较采用四格表χ2检验；影响因素分析采用多因素非条件Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组性别、年龄、民族、吸烟史、饮酒史、TC、APOA1及APOB比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组高血压和糖尿病合并情况、收缩压、舒张压、FPG、TG、LDL-C、HDL-C及Lp（a）比较，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1、2）。

2.2 基因型检测结果 两组均检测到CC基因型和CG基因型，各基因型的电泳锋型图见图1。两组基因型分布比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组等位基因分布比较，差异亦有统计学意义〔OR（95%CI）＝1.763（1.038，2.994），P＜0.05，见表3〕。

2.3 两组不同基因型受试者的血脂相关指标比较 对照组中，不同基因型受试者的TC、TG、LDL-C、HDL-C、APOA1、APOB及Lp（a）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。病例组中，不同基因型患者的TG、LDL-C比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而TC、HDL-C、APOA1、APOB及Lp（a）比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表4）。

2.4 IS影响因素的多因素非条件Logistic回归分析 以是否患IS为因变量，以一般资料比较中差异有统计学意义的因素为自变量，进行多因素非条件Logistic回归分析。结果显示，高血压合并情况、收缩压、FPG、TG、LDL-C及HDL-C对IS的影响有统计学意义（P＜0.05，见表5）。

3 讨论

IS是一种多基因遗传病，动脉粥样硬化是IS发病的主要病理学基础，脂代谢相关基因多态性与脂蛋白代谢异常密切相关并参与动脉粥样硬化的形成。因此，脂代谢通路相关基因突变与IS发病的关系研究已经成为IS遗传学的研究热点之一。而与脂代谢通路有关基因的研究，有助于深入阐明IS的分子遗传学机制，进而形成IS治疗新途径，即基因治疗。

表1 两组受试者一般资料比较（计数资料）Table1 Comparison of general data between the two groups

表3 两组受试者基因型和等位基因分布比较Table 3 Comparison of genotypes and allele distribution between the two groups

图1 不同基因型电泳峰型图Figure 1 Electrophoresis peak figure of different genotypes

表2 两组受试者一般资料比较（计量资料，±s）Table 2 Comparison of general data between the two groups

表2 两组受试者一般资料比较（计量资料，±s）Table 2 Comparison of general data between the two groups

注：FPG＝空腹血糖，TC＝总胆固醇，TG＝三酰甘油，LDL-C＝低密度脂蛋白胆固醇，HDL-C＝高密度脂蛋白胆固醇，APOA1＝载脂蛋白A1，APOB＝载脂蛋白B，Lp（a）＝脂蛋白（a）；1 mm Hg＝0.133 kPa

组别例数年龄（岁）收缩压（mm Hg）舒张压（mm Hg）FPG（mmol／L）TC（mmol／L）TG（mmol／L）LDL-C（mmol／L）HDL-C（mmol／L）APOA1（g／L）APOB（g／L）Lp（a）（mg／L）对照组350 61.8±0.6 130±1 79±1 5.5±0.1 4.27±0.07 2.04±0.07 2.79±0.06 1.05±0.02 1.25±0.01 0.89±0.04 194.58±7.15病例组414 61.8±0.6 145±1 86±1 6.9±0.2 4.39±0.05 1.91±0.06 2.52±0.04 1.36±0.05 1.20±0.01 0.90±0.03 173.10±6.07 t 99 0.88＜0.01 3 2.24 P值0.76＜0.01＜0.01＜0.01 0.18＜0.01 0.01＜0.01 0.值0.03 8.97 7.35 6.58 1.39 1.55 4.26 6.39 2.90 0.1

表4 两组不同基因型受试者的血脂相关指标比较（±s）Table 4 Comparison of indicators relevantwith blood lipid between two genotypes in the two groups

表4 两组不同基因型受试者的血脂相关指标比较（±s）Table 4 Comparison of indicators relevantwith blood lipid between two genotypes in the two groups

基因型例数TC（mmol／L）TG（mmol／L）LDL-C（mmol／L）HDL-C（mmol／L）APOA1（g／L）APOB（g／L）Lp（a）（mg／L）对照组CC 315 4.29±0.07 2.06±0.08 2.51±0.04 1.35±0.05 1.21±0.02 0.89±0.04 174.02±6.55 CG 35 4.12±0.21 1.91±0.16 2.60±0.14 1.48±0.17 1.17±0.03 0.94±0.04 164.87±14.48 t 0.78 0.66 0.65 0.86 0.75 0.44 0.45 P值值0.40 0.08 0.40 0.30 0.35 0.76 0.26病例组CC 390 4.39±0.05 1.92±0.06 2.81±0.05 1.05±0.02 1.25±0.01 0.89±0.04 192.22±7.17 CG 24 4.27±0.19 1.76±0.13 2.43±0.13 0.99±0.05 1.26±0.04 0.84±0.05 232.84±40.74 t 0.57 0.65 1.95 0.86 0.24 0.29 1.33 P值值0.95 0.04 0.04 0.36 0.69 0.78 0.13

表5 IS影响因素的多因素非条件Logistic回归分析Table 5 Multivariate unconditional Logistic regression analysis of influencing factors for IS

PCSK9基因是参与家族性高胆固醇血症常染色体显性遗传相关的第3个基因。PCSK9在脂质代谢异常、高胆固醇血症及动脉粥样硬化的生化过程中起着非常重要的作用，是血浆胆固醇代谢的主要调节因子之一［5］。LDL水平主要由肝脏中LDLR决定，LDLR活动由PCSK9基因在翻译水平上决定。Rousselet等［6］首次证明了内源性PCSK9可以通过控制LDLR来控制小鼠脑梗死过程中的LDL水平。Tavori等［7］的研究结果显示，在IS的发生发展过程中，内源性PCSK9可以调节LDLR水平；在病理状况下，PCSK9过度表达可引起血清诱导神经元凋亡等。表明PCSK9可能参与了神经元凋亡过程，在大脑发育过程中PCSK9增强了LDLR的蛋白质降解。Tran－Dinh等［8］的研究结果还表明，PCSK9抑制剂可以降低LDL水平，但不会增加急性脑梗死后的出血并发症发生风险，这些都为PCSK9的抑制剂治疗提供了理论基础。

既往研究显示，PCSK9可以增加冠心病和IS的患病风险［9－12］。Saade等［10］通过研究发现，PCSK9与动脉粥样硬化形成有关，E670位点的G等位基因频率在冠心病患者组明显高于对照组；IS患者的TG和LDL水平与E670位点G等位基因有关。而Hsu等［11］针对台湾地区人群的研究显示，冠心病患者和健康对照组的E670位点G等位基因频率无差异。Abboud等［12］在对E670位点G等位基因与IS危险因素的研究中发现，大动脉粥样硬化型脑卒中的发生风险与PCSK9基因突变有关，可能由严重颅内动脉硬化引起。Slimani等［13］的研究结果显示，PCSK9基因的E670G位点是突尼斯人群发生IS和冠心病的独立危险因素。Xu等［14］对PCSK9基因rs11206510位点的多态性进行研究，发现中国汉族人群的等位基因C与LDL-C水平升高有关，这与本研究结果一致。而Guella等［15］针对意大利人群的研究显示，等位基因C与低LDL-C水平有关，这可能与种族和地域不同有关。

根据PCSK9基因多态性与血脂异常和脑血管疾病的相关研究，本研究选取我国新疆地区的人群为研究对象，以PCSK9为候选基因。结果显示，CC基因型IS患者的血清TG和LDL-C水平比CG基因型患者高，而不同基因型对照组受试者的血清TG和LDL-C水平无差异。PCSK9基因rs529787位点的C等位基因在IS患者中的携带频率高于对照组，突变型G等位基因携带频率低于对照组，表明当个体携带C等位基因时IS相对患病风险增加1.763倍。可见，在新疆地区人群中，PCSK9基因rs529787位点多态性与血脂和IS的发生发展有关。有研究结果显示，PCSK9发生功能损失或基因突变可降低LDLR降解水平，使血浆LDL-C水平降低，可以减少80.0%的心脑血管事件发生，且可使血浆LDL水平下降0.52 mmol／L，冠心病发生风险下降50.0%［16］。可见，抗PCSK9治疗可以有效降低LDL-C水平，可以将PCSK9基因治疗作为临床控制血脂水平的新切入点，通过调节LDLR水平间接控制LDL-C水平，从而降低心脑血管疾病的患病风险。本研究中未发现GG基因型的出现，这可能与样本数量不足或地区、人群差异有关。另外，本研究结果显示，病例组和对照组的高血压和糖尿病合并情况、收缩压、舒张压、FPG、TG、LDL-C、HDL-C及Lp（a）比较，差异有统计学意义；将有统计学意义的因素纳入多因素非条件Logistic回归分析，结果显示合并高血压和较高的收缩压、FPG、TG、LDL-C是IS发病的危险因素，而HDL-C是其保护因素。HDL-C是逆向转运的内源性胆固醇酯，在降低血液中胆固醇酯、抗氧化方面具有重要作用，因此提高HDL-C水平可有效改善血脂状况，降低IS发病风险。

综上所述，PCSK9基因rs529787位点多态性与血脂和IS中的关系已得到初步证实，该类研究有助于IS基因学机制的进一步理解和新型药物治疗方案的制定。但考虑到地区、环境、生活习惯及种族等的局限性，此结论尚有待大样本、多中心、长期前瞻性病例对照研究来证实。

作者贡献：张艳进行试验设计与实施、撰写论文、成文并对文章负责；张艳、韩登峰进行试验实施、评估、资料收集；张小宁进行质量控制与审校。

本文无利益冲突。

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Correlation Between PCSK 9 Gene rs529787 Polym orphism and Blood Lipid and Ischem ic Stroke

ZHANG Yan，HAN Deng－feng，ZHANG Xiao－ning.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China

ObjectiveTo investigate the correlation between PCSK9 gene rs529787 polymorphism and blood lipid and ischemic stroke（IS）.M ethodsFrom July 2012 to July 2015，we enrolled 414 IS patients who received treatment in Department of Neurology of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，and we also enrolled 350 healthy adults who received physical examination in the same hospital as control group.Clinical data，genotype and allele distribution of the two groups were compared and analyzed.ResultsThe two groups were not significantly different in gender，age，ethnic group，history of smoking，history of alcohol consumption，TC，APOA1and APOB（P＞0.05）；the two groups were significantly different in the combination of hypertension and diabetes，systolic pressure，diastolic pressure，FPG，TG，LDL-C，HDL-C and Lp（a）（P＜0.05）.The two groupswere significantly different in the distribution of genotype（P＜0.05）；the two groups were significantly different in allele distribution〔OR（95%CI）＝1.763（1.038，2.994），P＜0.05〕.In control group，subjects with different genotypeswere not significantly different in TC，TG，LDL-C，HDL-C，APOA1，APOB and Lp（a）（P＞0.05）.In case group，subjects with different genotypes were significantly different in TG and LDL-C（P＜0.05），butwerenot significantly different in TC，HDL-C，APOA1，APOB and Lp（a）（P＞0.05）.Multivariate unconditional Logistic regression analysis showed that comp lication with hypertension，systolic pressure，FPG，TG，LDL-C，HDL-C had significant influence on IS（P＜0.05）.ConclusionISpatientswho have CC genotype at PCSK9 gene rs529787 locus have lower levels of serum TG and LDL-C，TG，LDL-C and HDL-C are influencing factors for IS，and allele Cmay be a susceptive factor for IS.

Stroke；Single－nucleotide polymorphism；Proprotein convertase subtilisin／kexin type9；Dyslipidemias

R 743

A

10.3969／j.issn.1007－9572.2016.07.014

2015－11－26；

2016－01－11）

（本文编辑：王凤微）

国家自然科学基金资助项目（81160145）

830054新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院神经内科

张小宁，830054新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆医科大学第一附属医院神经内科；E－mail：zxn－1960＠163.com