复合纤维素分解菌的探讨

文│王琳 王新梅 王蓓蓓（安徽省凤阳县畜牧兽医局）

复合纤维素分解菌的探讨

文│王琳 王新梅 王蓓蓓（安徽省凤阳县畜牧兽医局）

近年来，农作物秸秆和畜禽粪肥的不合理利用，既造成了生物资源的浪费，又污染了环境。如何将这些生物资源“变废为宝”是目前亟待解决的问题。大量试验研究表明，这些废弃物的主要有机成分是纤维素，由于秸秆中木质纤维素占干重的40%～60%，且自然状态下极难分解。因此，纤维素的生物降解已成为生物技术处理有机固体废物的关键，也是生物学领域的热点问题。

本文从土壤和不同材料的堆肥中分离筛选高效纤维素分解菌，并研究其对温度、pH的适应性，以便对纤维素分解菌进行优化来加快堆肥的腐熟进度。

一、材料与方法

1.试验材料。

（1）样本。从凤阳县府城镇及周边地区采集鸡粪、农作物秸秆及一些腐殖质等。从采集的样本中筛选得到相关菌种。

（2）培养基。初筛培养基：NaNO32.5克，KH2PO41克，CaCl2·6H2O 0.1克，MgSO40.3克，NaCl 0.1克，FeCl30.01克，滤纸条10克，蒸馏水1000毫升，温度121℃，灭菌20分钟。

复筛培养基：羧甲基纤维素钠培养基（CMC培养基）。NaCl6克，MgSO4·7H2O 0.1克，KH2PO40.5克，CaCl20.1克，K2HPO42.0克，CMCNa 15克，（NH4）2SO42.0克，pH7.0～7.4，蒸馏水1000毫升，固体培养基加2%琼脂。

优化培养液：Mandels培养基。KH2PO43.0克，CaCl20.5克，MgSO4·7H2O0.5克，NaCl0.1克，FeCl30.01克，NaNO33.0克，FeSO4·7H2O 7.5毫克，MnSO4·7H2O 2.5毫克，ZnSO4·7H2O 2.0毫克，CoCl23.0毫克，H2O 1000毫升，121℃灭菌20分钟，pH7.2～7.3。

（3）无淀粉滤纸。滤纸用1%醋酸浸泡24小时，用碘液检查确定无淀粉后再用2%苏打水冲洗至中性，晾干，将处理后的滤纸剪成小条待用。

2.试验方法。

（1）初选。初选是将原始菌种接种在初筛液体培养基中增殖培养。样品用生理盐水浸泡30分钟，充分震荡，吸取上清液1毫升接种到20毫升的三角烧瓶初筛培养基中，30℃恒温震荡摇床60转/分钟的条件下培养3～7天后，观察滤纸的崩解程度，选择滤纸条崩解程度较高、速度最快和效果稳定的培养液进行固体分离纯化培养。

（2）复选。复选是将初选菌种接种在固体培养基上进一步纯化分离。用接种环从有滤纸水解的三角烧瓶中蘸取分解菌，在贴有滤纸的复选平板上画线，32℃下培养7天。对滤纸的分解效果测定是将各菌株接种到以滤纸为惟一碳源的CMC培养基中，观察滤纸的崩解效果，以“+”的多少来表示滤纸崩解程度，“+”越多说明该菌株的降解效果越强，并计算CMC酶相对活性H=T/t（厘米/天），式中：H为相对活性；T为透明圈直径；t为培养时间。重复此操作选择分解纤维素能力强的菌落，将其放入4℃的冰箱保存，以备优化分析用。

（3）菌种的条件优化。将复选的菌种在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃条件下分别接种在pH为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的Mandels培养基中，观察并记录滤纸条的崩解速度。

将每组筛选的最优pH条件下的菌种再次接种，放在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃条件下培养，选出温度和pH间最优的关系。

二、结果与分析

1.菌种的筛选。采用以滤纸为惟一碳源的培养基，从土壤和不同材料的堆肥中筛选纤维素分解菌，经多次富集增殖培养后，获得10组具有纤维素降解功能的微生物，其中混合菌株H4具有稳定的分解纤维素效果，在以滤纸为碳源的液体培养基中发酵7天，滤纸全部崩解，并没有絮状沉淀，形成完全溶解的黄色稍黏稠发酵液。

将H4混合菌株用CMC平板进行分离纯化得到单个菌株D1（放线菌）、D2（细菌）、D3（真菌），比较单个菌株以及相互混合对滤纸分解的效果（表1），结果表明各菌株单独培养对滤纸均有一定的分解效果，但远不如混合的效果好，由此说明3株菌株之间有很好的协同效应，故选择混合菌H4作为优化菌种。

2.菌种不同温度下最适pH变化。

（1）分别在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃条件下优化。将H4分别接种在装有滤纸条、pH为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的Mandels培养基中，分别在28℃、32℃、35℃、38℃、40℃恒温振荡摇床上培养7天观察结果（表2）。

试验结果表明，温度在28℃时，偏酸性的环境更有利于滤纸的分解，pH过高反而抑制滤纸的分解；在32℃时纤维素分解菌最适分解的pH为中性；在35℃时纤维素分解菌最适分解的pH为7.2，偏碱性，温度较高时，酸性条件下不适宜H4混合菌对滤纸的分解，分解速度明显变慢。由此可得出，H4混合菌在pH分别为6.8、7.0、7.2时分解滤纸能力最强。

3.最适温度的条件优化。将H4混合菌接种在pH分别为6.8、7.0、7.2带有滤纸的Mandels培养基中，温度分别为28℃、32℃、35℃、38℃、40℃的振荡摇床60转/分钟的条件下培养，直至滤纸完全崩解时所用的天数，并记录（表3）。

本试验通过多次分离筛选得到纤维素分解菌，秸秆的分解是由各种微生物参与的生物氧化降解过程。微生物分解会产热，致使秸秆堆内温度升高，达到一定温度时会导致微生物出现死亡或休眠，从而引起堆体温度下降，下降到最适温度时，休眠状态的微生物开始继续活动，如此反复。正是由于秸秆堆在发酵过程中温度的变化，因而测定不同温度对纤维素分解菌纤维素酶活性的影响，对于筛选高效的纤维素分解菌具有重要的实践意义。

同时提取出来的H4混合纤维素分解菌包括细菌、真菌、放线菌，即细菌的最适温度在35～37℃，pH在7.2～7.6；真菌的最适温度在28～30℃，pH在6.5～6.8；放线菌的最适温度在23～37℃，pH在7.5～8.0，因而测定不同温度和pH对H4混合菌酶活性的影响，对于筛选高效的纤维素分解菌具有重要的实践意义。

表1 不同菌株对滤纸的分解效果

表2 不同温度下纤维素分解菌分解滤纸能力由强到弱顺序

表3 滤纸完全崩解时所用的天数

三、结论

纤维素分解菌的分离还存在一些争议，但通过与单一菌株的混合发酵相比，H4混合菌可使纤维分解能力明显提高，这是由于不同菌株产生不同类型的纤维素酶，混合后相互作用的结果。试验表明：纤维素分解受pH和温度影响较大，发酵过程中需调节发酵液的pH，保持中性或偏碱性可达到很好的分解效果；温度在35℃时纤维素分解酶活性最强，分解速度最快。H4混合菌的最适温度是35℃，最优pH为7.2，可以看出H4混合菌中含有大量的细菌和放线菌，而真菌受到抑制。因此选择滤纸作为碳源是较好的纤维素分解菌初选和增殖的培养基，为降解秸秆和有机废弃物对环境的污染有重要意义，同时也可以利用纤维素分解菌分解秸秆生产酵母蛋白饲料提供有效参考。

试验结果显示，经过筛选的混合菌株具有较强的协同作用，对纤维素有很好的降解能力，对其进一步优化降解能力明显增强。这对我国农村秸秆和城市有机废弃物的处理将有非常广阔的应用前景。