小口径人工血管构建研究现状与展望

姜 力 陈思原 王园园 王淑芳

(南开大学生命科学学院, 生物活性材料教育部重点实验室, 天津 300071)

小口径人工血管构建研究现状与展望

姜 力 陈思原 王园园 王淑芳*

(南开大学生命科学学院, 生物活性材料教育部重点实验室, 天津 300071)

人工血管在临床上的需求不断增长，但问题也较普遍，特别是小口径人工血管植入后再狭窄率较高，其低通畅率限制了其临床应用。本文介绍了小口径人工血管构建研究的国内外发展动态，包括人工血管支架的制备及修饰方法，细胞及细胞外微环境在人工血管构建中的作用，并对小口径人工血管构建面临的问题及研究方向进行了讨论与展望。

人工血管；生物活性物质；血管构建；再狭窄

引言

全世界医疗领域对血管替代物的需求持续增长。血管病变，如动脉粥样硬化，可引起血管内膜层下斑块的积累，造成下游组织血流量减少，严重的会导致患者死亡[1]。美国每年有140万的患者需要移植血管，花费超过250亿美元[2]。

血管移植物一般分为3种：自体血管、同种异体血管和合成血管。其中自体血管最为合适，但数量有限，会给患者造成机体损伤；同种异体血管易发生免疫排斥反应；合成血管则受限于支架直径大小。合成高分子材料，即由膨体聚四氟乙烯(ePTFE)[3]或涤纶(Dacron)等材料制成的血管支架，已成功应用于大口径血管，但小口径血管(直径≤6 mm)至今尚未得到成功应用。

构建小口径人工血管的主要手段是组织工程(tissue engineering)，即应用生物学和工程学的原理来构建新型的组织工程人工血管(tissue engineered vascular grafts，TEVGs)[4-7]。传统的组织工程血管构建方法包括支架、种子细胞和生物反应器三要素，需要在体外将细胞种植于支架上，培养一定时间后植入体内。另一种思路被称为“诱导性组织工程血管”，也叫“原位再生型组织工程血管”，即单纯依赖血管材料，使其在体内捕捉相关细胞(如内皮祖细胞)或依靠血管细胞的迁移和分化来实现血管再生。

影响血管再生的因素是多方面的，包括炎性反应、细胞来源、材料的细胞化等。细胞的来源及其与血管功能重建之间的关系一直为人们所关注。对血管支架的研究还包括用支架模拟细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的成分和结构，促进细胞的募集、黏附、增殖、分化及新组织的再生[6, 8]。这些研究为构建低免疫原性，抗血栓且具有生物反应性和生理功能的人工血管奠定了基础。此外，为进一步满足临床需求，还需降低TEVGs的制备成本[9]。

1 人工血管的制备及修饰

人体天然血管壁由内膜、中膜和外膜[10]组成(见图1)。三层膜分别由不同的细胞及组织构成，具有不同的功能(见表1)。血管壁中的弹力膜使三层膜相互分离。

图1 血管壁结构[10] Fig.1 Schematic representation of distinct layers of arterial wall[10]

血管结构细胞及组织功能内膜 内皮细胞(endothelialcells,ECs)防凝血、感染和炎症,调节气体和分子的交换等中膜 平滑肌细胞(smoothmusclecells,SMCs)、弹性纤维维持血管弹性外膜 成纤维细胞、神经细胞,胶原、弹性纤维增加血管刚性

1.1 人工血管的基本要求及血管支架的构建方法

为适应体内的复杂环境，血管支架要满足以下几个方面的要求：

1)力学特性：具有一定的机械强度，在体内能承受一定的压力而不变形。

2)可降解性：体内降解速率与组织再生速度匹配。

3)生物相容性：不引起炎症反应和毒性反应。

4)表面生物活性：利于细胞的黏附、生长和增殖。

5)合适的多孔结构[11]。

具体要求包括：人工血管的爆破压不小于1 700 mmHg，对生理循环的疲劳耐受最少达到30 d(体外实验)[12]，植入期间口径不发生明显的扩张，可自体内皮化等。

但通常情况下，小口径人工血管，在植入后几个月之内，由于与天然血管的顺应性不匹配，会产生免疫排斥、血栓、动脉瘤和内膜增生等问题[13-16]。

制备血管支架的技术包括相分离、自组装和静电纺丝等[17]。其中，静电纺丝技术(简称“电纺”)由于材料来源广泛且制备的纤维直径近似于ECM中的纤维，得到广泛应用。电纺纤维可诱导细胞定位和胞外基质蛋白的聚集，为细胞的黏附和生长提供适宜的环境。电纺材料可分为两类：天然高分子和合成高分子(见表2)。两种材料具有不同的特点，互补性很强。理想的复合纤维支架应在具备合适的力学性能的同时具有生物活性[18]，使其能够适应体内的复杂环境。

表2 电纺材料种类及特点Tab.2 Types and characteristics of electrospinning materials

完整内皮层的形成对TEVGs功能的正常化非常重要。为实现小口径TEVGs内皮化，通常需要在体外预先种植ECs，并借助生物反应器进行组织培养。可采用自组装细胞膜片技术来构建具有完整ECs层的TEVGs。该技术过程是：先在基质表面种植并培养血管细胞(如成纤维细胞和SMCs)，然后将形成的细胞膜片包裹在圆轴上(见图2)[19]，制成由成纤维细胞层包裹着平滑肌细胞层的血管三维支架，最后在管腔内接种ECs。

图2 从细胞层到三维血管的制备过程示意图[19] Fig.2 Schematic illustrating the process of creating a 3D vascular conduit from a 2D cell layer[19]

基于膜片技术的TEVGs还首次被应用于临床[20]。该技术可使用患者自身血管细胞，避免了植入后的免疫排斥反应。但是体外培养细胞时间过长(6～8周)，过程复杂，无法及时满足患者的需求。

此外，人们还尝试利用天然的组织构建TEVGs。如将去细胞小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，SIS)用作血管替代物。SIS由胶原、纤维蛋白、蛋白多糖和黏多糖等构成，力学性能优良。其缺点是有可能携带有病原菌[21]，存在生物相容性和安全性问题。

为促进宿主细胞的浸润和生长，合成材料的TEVGs还需具备可生物降解的特性。使其在新生血管形成过程中被逐步降解吸收；降解同时留出空间，便于细胞浸润生长。依据在体外是否脱去细胞，经典的可降解TEVGs植入策略有两种[22-23]。

第1种方法是先从患者静脉壁上分离细胞并在体外扩增，接着种植到可生物降解支架上，然后将支架连同细胞植入患者体内。支架会在几个月的时间内降解并被机体所吸收。

第2种方法是在可降解支架上培养细胞，得到细胞分泌的胞外基质蛋白后再脱去细胞和材料并冷冻保存。使用时根据需要可直接植入人体(直径不小于6 mm)或在基质上种植接受者的内皮细胞后再植入(直径3～4 mm)。

以上方法均体现了组织工程在血管制备方面的优势，利用了天然和合成材料各自的优点，但问题同样存在。例如，细胞的体外扩增培养时间较长，成本较高，易受到细菌感染等。

1.2 血管支架的修饰

为增强血管支架的表面活性及生物相容性(如抗凝血)，需要对其进行一定程度的修饰。支架材料表面修饰的方法有很多种，如共价修饰(抗原-抗体、蛋白与蛋白间的亲和作用等)及非共价修饰(生物活性分子的吸附、涂层等)。其中生物活性分子(如肝素、生长因子、蛋白多肽、壳聚糖、胶原等)因其优良的生物相容性及与细胞相互作用的能力，在人工血管构建中得到广泛关注。

Sato等将丝素蛋白涂覆在支架上以改善生物相容性[24]。还有实验室使用壳聚糖-胶原蛋白-热塑性聚氨酯纳米纤维支架，通过戊二醛蒸汽交联[25]以制得血管支架。该支架易弯曲，可承受高强度的拉力，对内皮细胞具有较好的细胞相容性。

Soletti等将去细胞的聚氨酯支架作为动脉介入支架，植入大鼠体内[26]。在支架的内侧覆有抗凝血的甲基丙烯酰氧乙基和磷脂共聚物。24周后与无磷脂的支架相比，涂有磷脂的支架上血小板黏附明显减少，通畅性得到改善。

Wise等利用电纺制造了一种重组人类弹性蛋白原/PCL支架[13]。将10% 总浓度的弹性蛋白原和PCL溶于六氟异丙醇，通过调整支架的力学性能来模拟人内乳动脉的弹性模量、顺应性、渗透性和爆破压。体内实验显示，与无弹性蛋白的支架相比，弹性蛋白/PCL支架的血小板黏附有所减少且内皮化程度增加。结果显示弹性蛋白原的加入显著促进了ECs的黏附和增殖。

此外，天然血管中ECs能够持续释放出一氧化氮(nitric oxide，NO)，其具有舒张血管、抗血液凝集的作用。可用NO供体或催化剂修饰血管支架，模拟原生血管的功能，减少血管再狭窄的发生[27-29]。作者所在实验室[30]制备了一种新型血管支架，即在电纺PCL材料上固载含有机硒催化剂的聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，SePEI)，与透明质酸层层自组装，同时在最外层连接REDV多肽。该支架可显著促进ECs的黏附，实现支架在原位的快速内皮化，为构建具有良好抗血栓性能和长期通畅率的人工血管提供了一种新思路。

2 细胞及支架结构在人工血管构建中的作用

理想的TEVGs应能够“现取现用”(off-the-shelf)，即人工血管产品可像药物一样随时取用。在原位组织工程(诱导性组织工程)中，无细胞支架作为生物反应器被植入患者体内，同时在血管组织形成的过程中材料会逐步降解，在体内通过支架材料对血管新生和细胞分化、增殖的诱导，促进组织的修复与再生，最终形成由患者自身细胞和组织所构成的新生血管。

2.1 血管重建中的细胞及细胞因子

人工血管的植入会使宿主组织产生一定程度的免疫反应，血管重建中也涉及到一系列的细胞及细胞因子(见表3)。

表3 参与血管重建的细胞及细胞因子Tab.3 Cells and cytokines in vascular remodeling

支架植入后，其与天然血管的缝合处会形成复杂的炎症环境，受损组织会释放出细胞因子。特别是由环境缺氧而引发的反应，其释放的趋化因子会调动周围细胞补充到受损的组织部位。

接着，细胞因子会刺激细胞黏附分子(如整合素)的表达，使细胞黏附到邻近受损区域的ECM和内皮上。同时，释放到周围环境中的细胞因子和自由基，刺激邻近的ECs、成纤维细胞、肥大细胞、噬中性粒细胞和单核细胞等参与炎症反应，同时伴随着基质降解酶，如基质金属蛋白酶的释放。巨噬细胞(macrophages)会从M1型(炎症型)转化为M2型(抗炎型)，其中，M2型巨噬细胞与炎症修复相关[31]。

此外，外周细胞和间充质干细胞(messenchymal stem cells，MSCs)也会受被高浓度趋化因子吸引，沿浓度梯度迁移并产生第二信使，进一步调节炎症和修复过程[31]。

组织修复中的主要信号蛋白包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子b(PDGF b)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和基质细胞衍生因子1α (SDF1α)。其中，SDF1α是在组织受伤和缺氧环境(如骨髓中)高度表达的趋化因子，其高度保守，在不同物种和多种组织(如脑、肾、肺、心和血管)中表达。具有吸引祖细胞和修复损伤组织的作用。在TEVGs中，可利用生物活性因子在材料中的传递，帮助血管形成新的组织。例如，人体实验证实，SDF1α的传递会加强组织的修复[31]。

炎症反应在TEVGs重建过程中起重要作用[32]。该实验在可生物降解的涤纶支架上种植人的骨髓细胞，接着植入小鼠体内。骨髓细胞和渗入支架的单核/巨噬细胞会释放出多种血管生成素和生长因子，随后，血液中的祖细胞(progenitor cell)及邻近的血管成熟细胞(SMCs或ECs)向支架方向迁移和增殖；最后支架中的细胞组织形成成熟的血管结构。随着支架的降解，在原位会形成新生血管。

除炎症反应外，研究显示，血管内膜增生中也有多种类型的细胞参与，包括SMCs、成纤维细胞、循环祖细胞、肌成纤维细胞和炎症细胞[33]。

在血管重建中，血管内层和中层的形成与再生非常重要。这将影响到新生血管是否具备基本的血管功能。

血管内层是由连续的单层ECs组成的，作为血管壁和血液之间的屏障，ECs能够合成并分泌调节血管平滑肌细胞的因子(如NO)，调节其表型，从而抑制其过度增殖。此外，血管的ECs还通过分泌各种血管活性物质来调节血管舒张、生长和重塑。

血管中层主要由SMCs构成，其与血管的舒张收缩有关。通常情况下血管的SMCs表现为收缩型，但在病理状态，如在动脉粥样硬化和高血压等疾病中，SMCs会发生表型转化，即由收缩型向增殖型转化，从血管壁中层迁入内膜并大量增殖，最终导致血管壁增厚，血管腔变窄。

2.2 人工血管的细胞来源

对于体外TEVGs构建而言，如何选择ECs和SMCs来源是TEVGs的一个难点[4]。从患者体内分离的成熟细胞是最佳来源，但难以获得，而且在年长患者体内细胞的增殖能力有限，无法满足血管细胞的增殖。在具有免疫原性低、增殖迅速及能分化为成熟细胞的干细胞被发现之后，人们逐渐倾向于在TEVGs的制备中使用干细胞。Krawiec等详述了骨髓单核干细胞，间充质干细胞和内皮祖细胞的应用，该应用主要集中于脱细胞支架或非电纺材料[34]。

而对于体内TEVGs构建而言，血管再生的细胞来源观点不一，包括骨髓和外周血、相邻血管及血管外部组织。只有认清细胞的来源，才能相对应地设计TEVGs的结构。人们也尝试设计了不同的支架来验证诱导性组织工程血管细胞的主要来源。

与人体血管移植后的情况不同，在小动物体内，血管再生易受到吻合处的细胞向内生长的干扰。为此，Talacua等设计了一种新的大鼠模型，该模型可通过Gore-Tex(ePTFE)的遮盖，抑制血管邻近组织的向内生长[35]。他们的实验说明，功能化的血管可以由血液携带的细胞在炎症反应下原位形成。实验中，将填充有纤维蛋白的PCL电纺支架予以改造，在其两端分别接上一段性别错配的动脉片段(见图3)，然后将其植入大鼠的腹主动脉。1～3个月后，超过90%的浸润细胞来源于血液，3个月后，形成了由SMCs、弹性纤维和具有方向性的胶原基质构成的血管中层，以及融合的ECs构成的血管内层。从而证明了循环系统中的细胞在原位组织工程血管构建中的潜力。

图3 带有雄性大鼠动脉片段的遮盖支架[35] Fig.3 The sex-mismatched shielded graft[35]

近期研究显示，新组织来源于TEVGs周围向内生长的血管细胞及邻近血管中的细胞，即透壁微血管的向内生长[36-37]。这与过去人们对TEVGs中出现的细胞主要来自于血液中的看法有所不同。

Hibino等的实验数据支持再生血管的ECs或SMCs来源于相邻的血管，而不是源于骨髓[36]。他们利用小鼠骨髓再造模型，将转基因雄性小鼠来源的骨髓细胞移植到雌性小鼠骨髓中，制备嵌合体小鼠，以研究材料中再生细胞的来源问题；此外，他们还使用一段雄鼠的天然静脉血管(Male IVC)与TEVGs连接后移植到雌鼠体内，考察细胞的迁移是否来源于相邻血管组织。

与上述实验结果不同的是，Pennel等认为内皮细胞主要来源于支架外侧透壁微血管的向内生长[37]。他们设计了一种支架来验证此观点，即用不同孔隙大小的支架相结合以考察内皮细胞的来源。同时通过延长支架的长度(环状支架)，避免相邻天然血管细胞向内生长对结果造成的干扰。研究发现，在排除了动物模型中吻合口处内皮细胞的过快生长所造成的干扰后，支架中间的ECs主要来源于血管周围的透壁微血管，这使得他们的结论更接近于人体新生血管的生成过程。

笔者认为，诱导性人工血管再生过程中细胞的来源与所构建的血管支架材料种类、支架的结构(孔径大小、孔隙率和致密程度)以及材料的顺应性、生物相容性等都有关系；血管材料不同，材料的修饰方法和负载生物活性因子不同，再生血管的细胞主要来源也会有所不同。

2.3 支架结构对细胞行为的影响

细胞的分化、增殖和胞外基质的产生受到生物体内微环境的力学强度和结构的影响。支架的结构设计(如纤维直径和取向、支架的三维结构、孔隙大小、表面形貌等)会对细胞的这些行为产生相应的作用。

自然状态下的ECM呈三维网络结构，其中的结构蛋白和多糖纤维直径均为纳米级50～500 nm[16]。新的电纺/网(electro-spinning/netting，ESN)技术[38-41]可制备出蜘蛛网般粗细的纳米级纤维网(直径<50 nm)[40]，使其纤维更近似于天然血管的ECM。

支架中纤维的取向对维持血管的正常功能起到重要作用。研究发现，大多数组织或器官(如坐骨神经、心脏、肌腱和血管)中的ECM具有各向异性的结构[8]。但是电纺制成的纤维是随机取向的，这与天然的ECM有所差别。因此需要制备均一取向的电纺支架来模拟天然纤维，引导细胞的迁移和伸展[8, 42]。不同类型的电纺纤维支架(如轴向均一和径向均一)在细胞形态形成、细胞迁移和分化过程中均产生了较好的影响[43-45]。

Zhu等制备出一种双层血管支架——内层用湿法纺丝制成圆周取向的纤维，影响SMCs的排列方向；外层通过静电纺丝制成随机取向的纳米纤维，用于加强支架的力学性能及防止植入后的渗血(见图4)[46]。3个月的体内实验发现，SMCs类似于天然血管中的细胞形态。同时，实验还证明了圆周取向的纤维还可调节SMCs的表型——由合成型向收缩型转变。对新生血管的生理功能测试发现其对血管舒张和收缩剂均有一定程度的敏感性，说明该新生血管具备了一定的生理功能。

图4 轴向取向人工血管制备示意图[46](上图为轴向取向血管构建设计假说，下图为制备过程)Fig.4 Schematic illustrating the fabrication process of circumferentially aligned TEVG[46](The above showed the hypothesis of circumferentially aligned TEVG, the bottom showed the fabrication process)

具有三维复杂多孔结构的支架能够更好地模拟天然ECM，而通常制备的纤维结构是二维的，在三维组织中的应用有限[47-48]。利用电纺技术和其他技术的结合，可以制备出管状和螺旋状结构的纳米纤维支架。例如，Centola等开发了一种结合熔融沉积成型的电纺新技术，通过螺旋盘绕的PCL来加强和改善血管支架的力学性能[49]。实验中，种植到支架上的人MSCs分化为ECs。

为进一步模仿天然血管的复杂结构，人们采用不同的方法制备出多层支架。例如，通过在小直径接收棒(4 mm)上混纺聚二氧六环酮(PDO)和蛋白，可制得具有三层结构的支架(长20 cm、内径4 mm)[50]。此外，该种支架还可用卷起电纺纤维膜的方法制得[51]。 Ju等用共纺技术制备了PCL/胶原的双层支架，外层用较大孔隙加强SMCs的渗入，内层通过较小的孔隙来促进ECs的黏附[52]。他们还通过调节纤维直径来控制支架的微结构和力学特性。

除了对支架纤维直径的调节，还可通过支架纤维表面的特殊形貌(如细微纤维和纹沟)来调控所黏附细胞的排列分布。Uttayarat等用结合旋转投丝的电纺方法，在聚氨酯支架(长48 mm，内径4 mm)上形成了细微的纤维和纹沟[53]。他们研究了ECs在这些微图案化表面的定位及细胞因子(胞间黏附因子1，ICAM-1)的形成，并发现这些微图案能促进ECs在支架上的黏附和生长[53]。

3 结语

尽管小口径TEVGs的研究已经取得了显著的进展，但未来仍会面临着植入后感染、血管再狭窄和血栓等风险。解决这一系列问题涉及多个学科的研究领域，如材料学、组织工程学和生物学等学科。TEVGs的快速内皮化是其成功应用的关键之一。由于内皮化不足，植入后的血管再狭窄是TEVGs临床手术的重要难题，有10%～15% 的血管再狭窄发生于病人的冠状动脉、颈动脉和外周动脉的血管再生过程中[54]。

TEVGs的研究还涉及诸多的因素，例如植入前材料的选择与修饰，植入后引起的组织炎症反应分析，特别是人工血管重建过程中涉及的细胞的来源问题，这关系到支架的设计和制备。细胞的迁移、分化及由此产生的细胞信号及其分子机制还有待深入的探究。

此外，需要对诱导性组织工程血管进行长期的监测和更严格的功能评价，为临床应用奠定基础，最终实现小口径TEVGs的商品化，满足患者的不同需求。

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Progress and Prospect of Small-Diameter Vascular Grafts Research

Jiang Li Chen Siyuan Wang Yuanyuan Wang Shufang*

(KeyLaboratoryofBioactiveMaterialsforMinistryofEducation,CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)

There is a growing demand of vascular grafts for clinical treatment, the problem is also general, and especially the small-diameter vascular’s incidence rate of restenosis is high after implantation. Tissue engineering has been applied in the fabrication of vascular grafts, the bionic and tissue regeneration. Tissue engineered vascular graft have been developed as alternative to autografts, but the low patency limit their clinical application. In this review, we introduced the latest develepment of vascular grafts in both domestic and foreign research, including the fabrication and modification of artificial vascular scaffolds, the role of cellular and extracellular microenvironment in artificial vascular reconstruction. We also discussed the problems and prospects of the directions for the future research of tissue engineered vascular grafts.

vascular graft; bioactive substances; vascular engineering; restenosis

10.3969/j.issn.0258-8021. 2016. 03.014

2015-12-18， 录用日期:2016-03-15

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2012CB725204)；天津市自然科学基金(13JCYBJC249000)；教育部创新团队计划项目PCSIRT(IRT13023)

R318

A

0258-8021(2016) 03-0357-08

*通信作者(Corresponding author)， E-mail:wangshufang@nankai.edu.cn