双夏汤改善老年果蝇片段式睡眠的药效学研究＊

席 苑，张 琦，田 艳，张志千，庚 迪，林宏英，孙毅坤

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

双夏汤改善老年果蝇片段式睡眠的药效学研究＊

席 苑，张 琦，田 艳，张志千，庚 迪，林宏英，孙毅坤＊＊

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

目的：本文主要探究双夏汤水煎液冻干粉对正常雌性老年果蝇片段式睡眠活动的改善作用。方法：以果蝇为模式生物，使用果蝇自主活动监测软件对果蝇的自主活动进行监测，探究双夏汤对老年果蝇片段式睡眠的调节。结果：双夏汤冻干粉的最佳给药浓度为2.5%，最佳给药天数为4天。相比于正常对照组，双夏汤给药组、阳性药组的35日龄处女蝇睡眠时间均有所延长。但阳性药主要影响其白天的睡眠行为，双夏汤则显著影响其夜晚的睡眠行为，延长片段睡眠时间。结论：双夏汤水煎液冻干粉能有效改善年老果蝇的片段式睡眠，相比于阳性药，在治疗夜间间歇性失眠的同时，并未显著影响果蝇白天的活动，双夏汤可能更有助于果蝇睡眠-觉醒节律的调节。

双夏汤 老年果蝇 片段式睡眠 自主活动监测

失眠症是最常见的一种睡眠障碍性疾病，指患者对睡眠时间或质量不满足并影响日间社会功能的一种主观体验。目前，随着经济的快速发展，生活节奏的不断加快，失眠症的发病率也在不断升高。据2006年流行病学调查显示，失眠症发病率在美国为33%，在欧洲为4%-22%，在中国也高达10%-20%[1]。作为一种常见的生理心理疾患，失眠症可发生于各个年龄段，但在老年患者中发病率较其他年龄段明显增高，并且长期失眠加快衰老速度，与其他脏器功能紊乱和免疫功能下降也有一定的相关性[2]。在治疗方面，西医多用安定、佳乐定、水合氯醛等镇静药[3]，虽然见效快，但副作用明显。医药工作者正寻找各种替代和补充医学疗法用于失眠症的治疗[4]。

中医对于失眠的描述始见于《内经》，称其为“目不瞑”、“不得眠”、“不得卧”，《难经》中亦有“不寐”的说法[2]。“年过半百，其气自半”，因此老年人的失眠多是由正气亏虚、阴阳失调所致[3]。明代《医经秘旨》曰：“盖半夏得阴而生，夏枯草得阳而生，是阴阳配合之妙也”，准确地阐述了半夏、夏枯草的配伍意义[5]。明代《重订灵兰要览》言：“不寐之证，椿田每用制半夏、夏枯草各五钱，取阴阳相配之义，浓煎长流水，竞覆杯而卧”，所以半夏、夏枯草二药合用治疗失眠古而有之，并且主治阴阳失调、痰火内壅的失眠，又称双夏汤。

黑腹果蝇为节肢动物门昆虫纲双翅目果蝇科黑腹果蝇，幼虫腹部一侧可见到黑色的消化道，由此称之为黑腹果蝇。1830年人类首次描述黑腹果蝇，1901年Morgan将果蝇作为遗传学研究的实验材料，此后发现黑腹果蝇在遗传、代谢、节律、成瘾等方面与哺乳动物均具有很多相同的标准化特征[6-9]。加之其体型小、饲养简便、繁殖周期短等特性，使其具有作为模式生物的独特优势。果蝇应用于睡眠相关的研究始于2000年，在睡眠的神经生物学机制和相关基因研究方面日益受到人们的高度关注[10]。

2012年，英国学者Gilestro在Nature上发表文章[11]，首次介绍了新型果蝇活动采集处理系统。该系统是监测果蝇睡眠-觉醒活动的多媒体平台，旨在建立实验人员与无脊椎动物之间的通信关系。该系统也是一个完整的果蝇睡眠数据采集及分析系统，可通过视频成像分析数据。软件支持9通路同时监测，每组32只果蝇，不仅大大降低实验成本，还能提高实验效率。

本课题组前期已将该软件成功应用于果蝇睡眠的行为学监测，并且已研究证实双夏汤可改善睡眠剥夺果蝇的睡眠。在对果蝇进行的连续行为学观察后发现，果蝇在进入老年后出现与人类类似的睡眠现象——觉醒早、易被唤醒、入睡慢等。基于以上研究，本文旨在应用该软件对果蝇进行行为学监测，探究双夏汤对老年果蝇片段式睡眠的改善作用，为中医临床治疗失眠症提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

Canton S品系野生型黑腹果蝇的雌性处女蝇，由中国科学院生物物理研究所提供。

1.2 药物

夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗（批号：002256374638）。半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternata (Thunb.) Breit.的干燥块茎，本研究所用为半夏的炮制品法半夏（批号：310039125308）。上述药材均购于安国东方药城中药材有限公司，并由北京市药品检验所常增荣主任药师鉴定。戊巴比妥钠（批号：WS20060401），购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 试剂

玉米粉、黄豆粉、酵母粉（食品级），琼脂粉、麦芽糖、丙酸，购于北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.4 仪器

新型果蝇活动监测装置，自制；果蝇麻醉装置，自制；冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司，型号：LGJ-12）；智能人工气候箱（宁波江南仪器厂，型号：RXZ-280B）。

2 方法

2.1 双夏汤冻干粉的制备

取夏枯草25 g、法半夏25 g，10倍量蒸馏水浸泡30 min后煎煮两次，每次1 h。水煎液过滤浓缩后冷冻干燥，冻干粉得率为25.0%，冻干粉密封置-20℃冰箱保存备用。

2.2 正常培养基的制备

取玉米粉，琼脂粉适量，加蒸馏水，煮沸，备用；另取酵母粉，黄豆粉适量，加蒸馏水煮沸后，加入麦芽糖继续煮沸，与上述玉米粉溶液合并，搅拌均匀，稍凉后加入丙酸，混匀，倒入高压灭菌后的果蝇培养管，每管培养基厚度约为2 cm。冷却、待培养基凝固后备用。

2.3 含药培养基的制备

在基础培养基原料中加入一定量双夏汤冻干粉，按照基础培养基配制方法，配制质量分数0.10%、0.25%、0.50%、1.00%、2.50%、5.00%、8.00%的含药培养基。将含药培养基倒入一次性无菌平皿中，培养基厚度约为2 mm，冷却凝固备用。将监测管一端内插入培养基后拔出并蘸取融化好的蜡液进行蜡封，待蜡液冷却凝固后将另一端用棉球封住。

取戊巴比妥钠水溶液2.5 mg·mL-1，配制成0.05 mg·mL-1的含药培养基。将含药培养基倒入一次性无菌平皿中，培养基厚度约为2 mm，冷却凝固备用。将监测管一端内插入培养基后拔出并蘸取融化好的蜡液进行蜡封，待蜡液冷却凝固后将另一端用棉球封住。

2.4 果蝇饲养环境

将果蝇置于温度25±1℃、相对湿度50%-70%的环境中饲养，12 h自动光照-黑暗循环。

2.5 果蝇睡眠-觉醒活动监测

收集处女蝇，移入含培养基的果蝇监测管，开口端用棉花塞住，每支检测管内放1只果蝇。将果蝇监测管嵌入到果蝇活动监测盘上，每个摄像头可同时监测32只果蝇的活动情况。通过数据采集软件自动记录果蝇即时活动距离。数据采集软件以1 min为单位记录每一帧的活动情况测算距离，克服以往仅记录通过终点的次数以造成的假睡眠[11]。若5 min以内活动次数记录为零，即果蝇静止时间持续5 min时，此休息状态符合睡眠行为标准，认为果蝇处于睡眠状态，记为果蝇睡眠时间。待果蝇适应24 h后进行睡眠监测，统计24 h平均每只果蝇睡眠总时间、白天睡眠时间和夜间睡眠时间。

2.6 双夏汤冻干粉对果蝇睡眠活动的量效关系研究

以野生型Canton S品系黑腹果蝇作为观察对象，收集12 h内羽化未交配的处女蝇，采用乙醚麻醉，将处女蝇置于含有基础培养基的监测管中饲养，分为空白组和给药组，每组32只。于第4日早7点给药，即将果蝇移入含有含药质量分数为0.10%、0.25%、0.50%、1.00%、2.50%、5.00%、8.00%的含药培养基检测管中。空白组移入不含药物的培养基监测管中。监测前适应环境24 h。

从第7日上午7：00至次日上午7：00，采用新型果蝇活动监测装置，以果蝇睡眠时间为评价指标，对果蝇睡眠活动进行24 h连续监测。

2.7 双夏汤冻干粉对果蝇睡眠活动的时效关系研究

以野生型Canton S品系黑腹果蝇作为观察对象，收集12 h内羽化未交配的处女蝇。麻醉后，将处女蝇置于含有基础培养基的监测管中饲养，分为空白组和给药组，每组32只。分别于第2、3、4、5日早7：00给药，即第2、3、4、5日将果蝇移入含有含药质量分数为2.50%的含药培养基检测管中。空白组移入不含药物的培养基监测管中。监测前适应环境24 h。从第7日上午7：00至次日上午7：00，采用新型果蝇活动监测装置，以果蝇睡眠时间为评价指标，果蝇睡眠活动进行24 h连续监测。

2.8 双夏汤对果蝇片段式睡眠的影响

以野生型Canton S品系黑腹果蝇作为观察对象，收集12 h内羽化未交配的处女蝇。乙醚麻醉后，将处女蝇置于含有基础培养基的监测管中饲养，分为空白组、阳性药组和双夏汤给药组，每组32只。31日后将空白组移入不含药物的培养基监测管中，阳性药组（给予戊巴比妥钠）移入含戊巴比妥钠培养基中，32日后将双夏汤给药组移入含有含药质量分数为2.50%的含双夏汤培养基检测管中，监测前适应环境24 h，在监测管饲养过程中死亡的果蝇，不再补充。从第35日上午7：00至次日上午7：00，采用新型果蝇活动监测装置，以果蝇睡眠时间为评价指标，对果蝇睡眠活动进行24 h连续监测。

统计数据以 表示，采用IBM SPSS Statistics 20.0 软件进行单因素方差分析，多组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05认为结果有统计学差异。

3 结果

3.1 正常雌性果蝇睡眠规律

35日龄果蝇出现片段式睡眠（图1）。正常3日龄果蝇和7日龄果蝇睡眠行为无显著差异（表1）。为缩短实验周期，选择3-7日龄作为时效关系研究的日龄段。结果发现7日龄后果蝇睡眠时间有所缩短，但在一个月后出现延长且呈现片段式睡眠。

3.2 不同给药浓度双夏汤冻干粉对果蝇睡眠活动的影响

在给予果蝇0.10%双夏汤冻干粉后，果蝇的总睡眠时间与空白组未见显著差异（P＞0.05）。给予果蝇0.25%双夏汤冻干粉后，果蝇的睡眠时间与空白组有明显差异（P＜0.05），即双夏汤冻干粉起效浓度为0.25%，随着给药浓度的增加，果蝇睡眠总时间持续延长至给药浓度为2.50%后出现平台期，即给药浓度2.50%、5.00%、8.00%组果蝇睡眠时间未见显著性差异。双夏汤冻干粉含药量大于0.25%后，对果蝇夜间睡眠活动调节效果显著（P＜0.001）。结果见表2、图2。

3.3 不同给药时间2.50%双夏汤冻干粉对果蝇睡眠的影响

由于3-7日龄果蝇睡眠时间较为稳定，故于果蝇羽化后第2、3、4、5日早7：00给药，结果与空白对照组比较。给药第2、3日与空白组比较未见显著差异，给药第4天差异最为显著，第4日后出现平台期，且有微弱下降趋势，但未见显著差异（P＞0.05），详见表3、图2。

3.4 双夏汤对年老果蝇睡眠活动影响

正常35日龄果蝇夜间出现间歇性睡眠，图3中黑色代表睡眠，白色代表觉醒，黑白均匀分布，代表年老果蝇夜间睡眠规律性觉醒。与正常组相比，双夏汤给药组、阳性药组睡眠时间均有所延长，但睡眠行为表现并不一致。阳性药组果蝇白天睡眠时间显著延长，夜间睡眠表现为：前半夜依然表现为规律性觉醒，而在凌晨果蝇出现了持续睡眠。因此，阳性药并未显著延长果蝇夜间睡眠，而主要对白天睡眠行为影响较大。双夏汤并未影响果蝇白天睡眠时间，也并没有影响果蝇的间歇性睡眠，而是延长了果蝇夜间睡眠时间，表现为：延长了每个睡眠-觉醒周期中的睡眠时间，黑色条带出现展宽，黑色条带并未见

出现在某一时期的集中展宽，展宽较为平均。结果见表4、图3。

图1 正常果蝇睡眠节律图

表1 正常雌性果蝇睡眠情况表

表2 不同双夏汤冻干粉浓度对果蝇睡眠活动的影响（n=32）

图2 量效关系曲线（A）、时效关系曲线（B）

4 讨论

本研究通过对正常果蝇睡眠行为的连续监测发现，35日龄果蝇出现片段式睡眠，前期研究结果表明雌性果蝇的睡眠-觉醒周期与人类睡眠行为更为接近，故本实验采用35日龄雌性果蝇为研究对象。雌果蝇生殖器官的受精囊可保存交配所得的大量精子而使卵细胞受精[12]，为便于后期研究，本实验采用的雌性果蝇均为处女蝇。

根据量效关系、时效关系实验结果，本实验采用质量分数为2.50%的双夏汤冻干粉，连续给药4天。结果表明双夏汤可对老年果蝇的片段式睡眠有显著的改善作用。但根据实验结果推测，双夏汤与戊巴比妥钠治疗老年性睡眠的机制并不完全相同，阳性药组虽延长了果蝇睡眠活动时间，且夜间出现不间断性睡眠，但夜间睡眠时间并未延长。双夏汤并未显著延长果蝇白天睡眠时间，但却影响了果蝇夜间睡眠，延长了片段式睡眠的片段时长。

Izac等[13]研究认为睡眠受昼夜节律和稳态过程相互作用的调节。昼夜节律的紊乱，最终引起睡眠障碍。其中，由松果体释放的褪黑素是调节人体节律的重要物质。除此之外，泌乳激素、和皮质醇等激素的分泌紊乱都有可能是引起失眠症的原因[14]。而随着年龄的增高，老年人机体内的环境稳定性和顺应性降低，生物机能紊乱，从而出现失眠的发病率增加[15]。

表3 不同给药时间双夏汤冻干粉对果蝇睡眠活动的影响（n=32）

表4 双夏汤对年老果蝇睡眠时间的影响

图3 双夏汤对年老果蝇睡眠行为的影响

因此，出于对老年患者机体老化的特殊性的考虑，现代医学以“按需治疗”和“小剂量间断”为治疗原则[16]，重视患者心理、环境及睡眠习惯的自我调节。与现代医学研究类似，双夏汤通过调理阴阳，循行营卫来改善老年患者的睡眠质量，两者的思路不谋而合。

王东明[17]研究表明，半夏可以通过降低血红细胞内超氧化物歧化酶活性及血清和肝组织中一氧化氮合酶活性，同时抑制组织中脂质过氧化程度等多种途径抑制中枢神经系统，从而达到镇静催眠的作用。

半夏与夏枯草这一药对配伍，“半夏得阴而生，夏枯草得阳而长”，顺应天时，交阴阳二气，使阳入于阴而化寐，故推断其对心肾不交造成的老年失眠有很好的改善。

双夏汤治疗老年间歇性失眠作用机制尚不明确，本课题组将针对该问题进行下一步研究。在此做出大胆猜想，双夏汤相对于本实验所用的阳性药，在治疗夜间间歇性失眠的同时，并未影响白天果蝇活动，可能更有助于睡眠节律的调节。

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A Pharmacodynamical Study on the Improvement of Senile Drosophilas with Fragmented Sleep with the Administration of Shuang Xia Decoction

Xi Yuan, Zhang Qi, Tian Yan, Zhang Zhiqian, Geng Di, Lin Hongying, Sun Yikun
(School of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed at unfolding the therapeutic effects of freeze-dried powder separated from Shuang Xia decoction (SXD) on female senile drosophila melanogaster with fragmented sleep. Taking drosophilas as the model organisms, the locomotor activity was monitored using the autonomic monitoring software to explore the regulation of fragmented sleep in senile drosophilas by the treatment of SXD. As a result, it was found that the optimum concentration of SXD was 2.50%, while the desirable therapeutic duration was 4 days. In comparison with the control group, 35-day-old virgin drosophilas'sleep was prolonged in the SXD group and the positive control group. The positive drug mainly affected their sleep in the daytime, while SXD impacted their sleep atnight featuring the prolonged fragmented sleep. In conclusion, it was demonstrated that the freeze-dried powder of SXD effectively alleviated intermittent insomnia in the female senile drosophilas. Compared with positive drug, SXD also mitigated intermittent insomnia at night without significant changes in the sleep of the drosophilas in the daytime. Above all, SXD was beneficial in the regulation of sleep-wake rhythm in the drosophilas.

Shuang Xia decoction, senile drosophila melanogaster, fragmented sleep, autonomic activity monitoring

10.11842/wst.2016.11.025

R28

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-05-06

修回日期：2016-09-30

＊ 国家自然基金委面上项目（81173521）：基于受体学说的双夏汤治疗失眠的物质基础与作用机制研究，负责人：孙毅坤；教育部中央高校基本科研业务费自主选题项目（2015-JYB-XS068）：基于果蝇为模式生物的双夏汤治疗失眠作用机制研究，负责人：张志千；北京中医药大学2015年国家级创新训练及北京市共建项目（BJGJ1527）：基于果蝇行为学半夏治疗失眠的有效组分研究，负责人：张琦。

＊＊ 通讯作者：孙毅坤，博士，教授，硕士生导师，主要研究方向：中药质量控制及中药成分分析。