Microtox（微毒）技术应用于红花注射液综合毒性检测＊

罗荔敏，鄢良春，卫天喜，华 桦，祝勇军，赵军宁＊

（1.华润三九（雅安）药业有限公司 雅安 625000；2.四川省中医药科学院中药药理毒理研究所/国家中医药管理局中药质量生物评价重点研究室/四川省道地药材系统开发工程技术研究中心/中药品质评价与创新中药研究四川省重点实验室 成都 610041）

Microtox（微毒）技术应用于红花注射液综合毒性检测＊

罗荔敏1＊＊，鄢良春2＊＊，卫天喜1，华 桦2，祝勇军1，赵军宁2＊＊＊

（1.华润三九（雅安）药业有限公司 雅安 625000；2.四川省中医药科学院中药药理毒理研究所/国家中医药管理局中药质量生物评价重点研究室/四川省道地药材系统开发工程技术研究中心/中药品质评价与创新中药研究四川省重点实验室 成都 610041）

目的：探索Microtox技术应用于红花注射液综合毒性检测。方法：以费氏弧菌为测试菌种，通过方法学考察确定最优检测体系及方法学可靠性；在最优检测体系条件下，对不同生产厂家所生产的红花注射液进行了发光菌综合毒性检测。结果：2 mL反应体系下，最优复苏液体积0.9 mL/支菌，每个待测样品加入最优的菌液体积50 μL，最优检测时间10 min，最优pH范围5-10，且10 min时发光强度以80-120万为宜；重复性试验、中间精密度试验的相对标准偏差均小于15%；不同生产厂家A、B、C成品的EC50平均值分别为3.36%、5.58%、4.33%，具有显著性差异（P＜0.05）。结论：红花注射液对费氏弧菌的毒性存在显著的浓度-效应关系，且不同生产厂家（包括原研单位在内）之间成品EC50值具有显著性差异，提示红花注射液成品生物学检测标准存在进一步提升的空间，应用Microtox技术检测红花注射液综合毒性并用于控制不同厂家成品质量的波动具有很好的应用前景。

Microtox技术 发光细菌 红花注射液 综合毒性

红花注射液是由菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花提取制备的灭菌注射水溶液，其主要成分为查尔酮类及黄酮醇类物质，具有良好的活血化瘀、消肿止痛的功效，临床常用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、闭塞性脑血管等疾病，疗效显著[1]。近年来，该药物在临床上得到广泛应用，适应症范围进一步扩大，但临床不良反应发生率也逐渐增多，主要表现为恶心呕吐、过敏性寒战、休克等，其中高龄患者居多，不良反应现象多发生在用药后30 min内且多数为首次用药[2]。红花注射液是心脑血管疾病中药注射剂中比较重要的一个分支，原有生产企业16家，经新版GMP及红花注射液新质量标准认证过后，现仅存5家企业继续生产，产品集中度及质量得到大幅度提升。本研究选取包括原研企业在内的3家代表性企业（企业A、企业B、企业C）所生产的红花注射液成品各3批次进行了Microtox技术生物学综合毒性测试。

赵军宁等[3]于2010年在新型中药质量控制模式的思路与方法——“功效-毒性-物质”的基础上，结合传统中药功能主治与现代药理、毒理及药物化学研究成果，建立了新型多指标质量控制与评价的方法体系。本研究探索了将Microtox技术运用于红花注射液综合毒性评价的可能性，为辅助该品种质量控制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验药物

红花注射液样品为来自A、B、C三家药企的成品，每个厂家各取3个批次，所有样品均为黄红色至棕红色的澄明液体。

1.2 菌种

菌种为费氏弧菌冻干粉试剂盒（北京滨松光子技术股份有限公司，菌种型号：CS234，批号：D15G001-D15G025），于-20℃条件下避光保存。

1.3 主要仪器与试剂

费氏弧菌复苏稀释液、费氏弧菌渗透压调节液（北京滨松光子技术股份有限公司，批号分别为20150820、20150820）；纯化水；BHP9514 发光菌测试仪（北京滨松光子技术股份有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 测定发光强度的方法

从冰箱取出费氏弧菌冻干粉1支（-20℃保存），室温（18℃-25℃）平衡15 min，加入0.9 mL复苏液，于室温下放置10 min后，作为测试用菌液备用。根据预实验结果，先将待测样品用纯化水稀释至合适的浓度后，再用渗透压调节液（17：3）混匀，作为待测样品溶液。每次试验均采用复苏稀释液作为空白对照。每支测试管中放入2 mL待测样品或空白对照液（n=3），分别向各测试管中加入50 μL测试菌液，轻轻震荡混匀，室温放置10 min，再用滨松发光菌测试仪读取各管发光强度值。

1.4.2 方法学考察

（1）测定方法影响因素考察

首先，考察复苏液体积、加入菌液体积及时间对空白对照管初始发光强度值的影响。向平衡后的费氏弧菌冻干粉中分别加入0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL复苏液进行复苏，10 min后分别取每个复苏液体积下的菌液20、30、40、50、60 μL置于装有2 mL稀释液的空白对照管中（n=3），轻轻震荡从混匀开始计时，每2 min测定1次发光强度值，比较不同复苏液体积、不同菌液加入量及不同测定时间对空白对照管初始发光强度值的影响。

然后，考察时间对不同浓度待测样品发光强度值的影响。向待测管中加入2 mL不同浓度下待测样品溶液（n=3），加入精密量取最优复苏参数条件下测试菌液，轻轻震荡从混匀开始计时，每2 min测定1次发光强度值，比较时间对不同浓度待测样品发光强度值的影响。

最后，考察pH对发光强度的影响。用NaOH溶液或HCl溶液与复苏稀释液以适宜的比例混合混合，配制pH为1、2、4、5、8、10、11、12、14的复苏稀释液；分别取上述复苏稀释液2 mL于测试管中（n=3），加入50 μL测试菌液，轻轻震荡使之充分混匀开始计时，每2 min测定1次发光强度值，比较pH对发光强度的影响。

（2）精密度考察

重复性考察的试验步骤：以“1.5.1”项下方法对不同厂家各个批次的红花注射液成品进行检测，每批样品平行3次试验，对结果进行分析。

另外，中间精密度考察的试验步骤分为2个方面：①不同人员：以“1.5.1”项下方法由不同的试验员在同一个工作日对同一批红花注射液成品进行检测，对结果进行分析；②不同工作日：由相同的试验员在不同工作日对同一批红花注射液成品进行检测，对结果进行分析。

1.4.3 费氏弧菌—红花注射液综合毒性评价

按照“1.5.1”项下方法，对不同厂家各个批次的红花注射液成品进行发光强度检测，并计算抑制率和半数抑制浓度（EC50值），根据EC50值对比各样品的综合毒性大小（EC50值与各样品的综合毒性成负相关）分析样品的综合毒性。

1.4.4 数据处理和毒性评价

抑制率计算公式如下：

采用Excel对数模型拟合并绘制浓度-抑制率曲线，根据曲线拟合公式计算样品的EC50值（半数抑制浓度），以EC50值表征红花注射液综合毒性的大小，并对数据进行处理和统计分析。

1.4.5 统计学方法

运用Excel 软件先进行F-TEST方差齐性检验，后进行T-TEST 双尾等方差检验。P＞0.05无显著性差异，P＜0.05有显著性差异。P＜0.01有及显著性差异。

2 试验结果

2.1 影响因素考察

2.1.1 复苏液体积、加入菌液体积及时间对空白对照管初始发光强度值的影响

由图1可见，固定加入不同体积的菌液、不同体积的复苏液会造成初始发光强度值随时间的走势不同，随复苏液体积增大初始发光强度值呈现先增高后降低趋势；固定复苏液体积，加入不同体积的菌液会造成初始发光强度值随时间的走势不同，随所加菌液体积增大初始发光强度值亦呈现先增高后降低趋势；说明测试用菌液中的菌液浓度不是越高越好。结合上述试验结果，为减小试验误差同时考虑成本问题，选取最优复苏液体积0.9 mL，每管加菌液体积50 μL、10-30 min内发光强度值基本没有太大变化可用于试验测定（初始发光强度值在80-120万之间为宜）。

图1 复苏液体积、加入菌液体积及时间对空白对照管初始发光强度值的影响

2.1.2 时间对不同浓度待测样品发光强度值的影响

由图2可见，不同浓度的红花注射液对费氏弧菌初试发光强度值的影响不同，低浓度促进发光，高浓度抑制发光，且中间浓度发光强度抑制率在15 min左右开始发生衰减。综合空白对照管的测试结果，设定红花注射液-费氏弧菌综合毒性评价体系参数为：复苏液0.9 mL，每管加入菌液50 μL，最优检测时间10 min。

2.1.3 pH对发光强度的影响

由图3可见，待测样品溶液pH在5-10 h对发光强度值的影响较小，相对偏差小于10%。

2.2 精密度考察

2.2.1 重复性

根据表1可见，重复性实验的相对偏差小于15%。

2.2.2 中间精密度

根据表2可见，中间精密度试验的相对偏差小于15%。

2.3 不同厂家红花注射液成品综合毒性比较

由表3和图4可见，不同生产厂家A、B、C的红花注射液成品EC50值差异较大T-TEST双尾等方差检验，P＜0.01有极显著性差异。

图2 时间对不同浓度待测样品发光强度值的影响

图3 pH对发光强度的影响

表1 3批生脉注射液成品重复性试验

表2 中间精密度试验试验

表3 不同厂家生脉注射液成品生物综合毒性结果

3 讨论

3.1 Microtox技术综合毒性评价体系

图4 不同厂家红花注射液成品生物综合毒性结果

图5 发光菌发光代谢过程和原理图

利用发光菌生理上的独特性，Microtox技术根据发光强度的变化检测待测样品的生物毒性，也是目前GB/T 15441-1995和ISO11348认证的急性毒理测试方法。细菌有很多种类，但是其发光原理是相同的，都是酶促氧化反应。一般主要有荧光素酶、FMN、NADH、NADPH、长链脂肪醛（RCHO）、分子氧等物质参与发光反应。在正常的生理条件下发光菌能发出波长在450-490 nm的蓝绿色可见光，发光强度在特定试验条件下是恒定的，发光强度在接触外来受试物时会发生变化，外来受试物抑制细菌发光主要通过2个途径：①直接抑制酶类参与发光反应的活性；②抑制与发光反应有关的细胞内代谢过程。原理图如下[4]：

该技术评价体系优点包括：①发光菌具有与高等生物类似的物理化学性质和酶促反应过程特点，模拟性强，是一种综合毒性检测方法；②该方法为国际公认的客观可靠的方法，且方法简单、便于操作、重复性好；③反应灵敏度高，比一般生物反应细胞灵敏几个数量级；④可以同时获得多个定量参数，EC50、标准毒物参比值、毒性剂量-效应动力曲线等多个定量参数的测定，综合表征上述注射剂毒性特点[5-13]。

3.2 红花注射液对发光菌的综合毒性

本研究首次应用一种Microtox技术方法测定了红花注射液成品的生物综合毒性，选取费氏弧菌作为发光菌测试菌种，考察并建立其生物综合毒性评价体系，确定最优复苏液体积为0.9 mL，最优菌液加入量为50 μL，最优检测时间10 min，最优pH范围5-10，且10 min时空白对照发光强度以80-120万为宜。在此体系下，重复性和中间精密度均良好，相对偏差小于15%，方法可靠。从研究结果分析，红花注射液对费氏弧菌的毒性存在显著的浓度-效应关系，且不同生产厂家（包括原研单位在内）之间成品EC50值具有显著性差异，提示红花注射液成品生物学检测标准存在进一步提升的空间，采用Microtox技术检测红花注射液综合毒性并用于控制不同厂家成品质量波动具有很好的应用前景。

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13 熊静悦,李孝容,鄢良春,等. 基于 Microtox 技术的中药注射剂微毒快速测试体系反应条件的优化与方法学的考察.中国中药杂志,2016,41(9)：1622-1626.

The Microtox-Based Fast Test of Comprehensive Toxicity of Safflower Injection

Luo Limin1, Yan liangchun2, Wei Tianxi1, Hua Hua2, Zhu Yongjun1, Zhao Junning2
(1.China Resources 999 Pharmaceutical Co., Ltd. (Ya'an), Ya'an 625000, China; 2.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu, 610041, China)

This study aimed at exploring a new method--microtox technology to evaluate the comprehensivetoxicity of safflower injections from different drug manufacturers. In the experiment, we investigated the characteristic parameters of vibrio fischeri (CS234) under different conditions, and then locked the optimum parameters for safflower injection assay： recovery liquid volume 0.9 mL in freeze-dried vial, 50 μL bacteria suspension in each sample, and the detection time of 10 mins after adding the bacteria suspension. Under this optimum detection condition, we found that the EC50values were 3.36%, 5.58% and 4.33%, being significantly different between 3 representative drug manufacturers (P ＜ 0.05). In conclusion, it was implied that the biological detection standards of safflower injections need improving, while the microtox-based fast test of the comprehensive toxicity of safflower injection showed a favorable and prospective application to controlling the product qualities of different manufacturers.

Microtox technology, luminous bacteria, safflower injection, comprehensive toxicity

10.11842/wst.2016.11.015

R285

A

（责任编辑：马雅静，责任译审：朱黎婷）

2016-11-15

修回日期：2016-11-20

＊ 科学技术部“重大新药创制”科技重大专项（2015ZX09501004-001-005）：基于Microtox（微毒）测试的中药安全性快速检测、质量控制与风险预警新技术研究，负责人：赵军宁；国家自然科学基金委面上项目（81470180）：基于Microtox技术的中药毒性分级原理与标准研究，负责人：赵军宁；国家中医药管理局公益性行业科研专项（201507004）：与临床病症相关的确有疗效常用中药炮制技术与配伍减“毒”研究——苍耳子，负责人：华桦；四川省科技厅定向财力转移支付项目（2015ZYZF0087）：红花注射液致不良反应物研究，负责人：祝勇军。

＊＊ 罗荔敏、鄢良春为共同第一作者。

＊＊＊ 通讯作者：赵军宁，本刊编委，博士，研究员，博士生导师，主要研究方向：中药药理学、中药质量生物控制、道地药材与民族药系统研究开发等。