间充质干细胞移植治疗糖尿病的研究进展

徐承雷 综述， 宋振顺 审校

(同济大学附属第十人民医院肝胆胰外科，上海 200072)



·综 述·

间充质干细胞移植治疗糖尿病的研究进展

徐承雷 综述， 宋振顺 审校

(同济大学附属第十人民医院肝胆胰外科，上海 200072)

糖尿病尤其是1型糖尿病(T1DM)，很大程度上与先天免疫缺陷有关，自身免疫攻击导致胰岛β细胞的破坏和胰岛素分泌不足，目前尚无有效方法根治糖尿病。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有强大的增殖分化能力及免疫调节功能。迄今为止，MSCs不论在体外诱导分化产生产胰岛素细胞(IPCs)，还是动物试验，均表现出令人鼓舞的效果，但研究仍处于早期阶段。本文介绍MSCs体外衍生为IPCs，作为一种潜在的治疗方法在实验动物模型以及在人体中的应用。

间充质干细胞； 糖尿病； 诱导分化； 产胰岛素细胞；

研究[1]显示，目前中国有超过1.1亿的糖尿病患者，约占全球糖尿病患者的1/3。但只有约1/4患者在接受糖尿病治疗，其中血糖水平控制良好的患者数量更少。世界正面临前所未有的糖尿病流行的问题，而中国已经成为全球糖尿病疾病负担最重的国家之一，预防和控制糖尿病的发生和发展是摆在政府和公众面前一个重要的问题。

1 糖尿病发病机制研究

根据美国糖尿病协会发布的糖尿病分型标准，糖尿病共分为4个类型，其中1型(T1DM)和2型(T2DM)是最重要也是最常见的类型。T1DM是一种由T淋巴细胞介导的、器官特异性的自身免疫性疾病，免疫攻击导致胰岛β细胞的破坏和胰岛素分泌不足[2]，病因主要包括自身免疫缺陷，如谷氨酸脱羧酶抗体(GAD抗体)、胰岛细胞抗体(ICA抗体)等出现异常，遗传因素，病毒感染等，甚至和某些不良的生活习惯及环境因素有关。目前，临床上多采用补充外源性胰岛素的方法治疗T1DM，但无法达到治愈效果。T2DM的发病机制主要包括胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能受损。发病早期胰岛素抵抗导致胰岛β细胞大量分泌胰岛素，当持续高血糖的葡萄糖毒性损伤胰岛β细胞后，细胞分泌功能受损，胰岛素水平下降，形成恶性循环。但由于胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能的异常，单独通过控制血糖，减少葡萄糖毒性后β细胞功能及胰岛素敏感性也无法完全恢复。T2DM中胰岛β细胞功能、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱与葡萄糖毒性关系错综复杂[3]，甚至全身多器官组织参与T2DM的发生及发展。

2 糖尿病的干细胞研究

干细胞是具有自我更新能力及多向分化潜力的一类细胞，根据其来源一般可以分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导性多能干细胞。其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是起源于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富。

2001年，Assady等[4]报道了利用胚胎干细胞成功分化为产胰岛素细胞(insulin-producing cells， IPCs)，尽管当时分化细胞的比例及分泌的胰岛素量不高，但第1次证实了干细胞可作为胰岛β细胞的潜在来源。MSCs相较胚胎干细胞而言更具优势，因为它们通常不形成畸胎瘤，且无胚胎干细胞经常涉及的伦理学问题。目前，已有文献[5-6]报道MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化成产胰岛素细胞，甚至可分化出胰岛结构，且MSCs强大的免疫调节功能能有效避免特异性免疫反应，因此干细胞体外诱导为产胰岛素细胞进而移植体内是治愈T1DM十分理想的方法。另外，MSCs的表面抗原不明显，故异体移植排异较轻，配型要求不严格。MSCs的优良特性为MSCs治疗糖尿病提供了理论依据。加上MSCs组织取材方便，分离纯化简单，多次传代扩增后仍具有干细胞相关特性，并且随着细胞纯化技术的进步，使得从组织中获取大量高纯度、高活力的MSCs成为可能，这大大提高了治疗的可行性，因此成为近年来的研究热点。

骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells， BM-MSCs)是此类研究最常用的细胞类型。BM-MSCs是取材最方便和来源最丰富的干细胞，因此大量用于体外诱导产胰岛素细胞，此外，脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells， UC-MSCs)、脐血间充质干细胞(umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells， UCB-MSCs)及脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells， AD-MSCs)也常用于诱导分化IPCs治疗糖尿病。

随着研究日渐深入，大量研究表明MSCs分化为IPCs能够治疗糖尿病，不仅仅是因为增加外源性产胰岛素细胞而导致的胰岛素分泌量增加，许多研究发现干细胞分泌的可溶性细胞因子在改善受体胰岛修复中发挥着非常重要的作用，其中较为重要的有SDF-1、VEGF、IGF-1、EGF、KGF、Ang-1、MIP-1α、MIP-1β、EPO、MMP-9等，刺激血管内皮细胞增殖和分化，促进血管生成和组织再生。另一方面，T1DM的胰岛炎可能刺激的MSCs分泌TNF-α、TSG-6、STC-1、SDF-1、IL-6、IL-8，抑制过度的免疫应答、抗胰岛细胞凋亡和保护受伤组织免受炎症。另外，干细胞直接的T细胞抑制，以及免疫耐受诱导的TGF-β和PGE2，也可能有助于干细胞介导的免疫抑制作用。据此，许多学者认为MSCs可能是治愈糖尿病的有效手段。

T2DM因其发病机制迥异于T1DM，干细胞治疗T2DM的有效性尚未完全认证，但已有研究[7-8]认为T2DM发病的中心环节不是单独的胰岛素抵抗，而是胰岛特别是胰岛β细胞的功能异常，因此，干细胞治疗T2DM依然是切实可行的。

3 间充质干细胞的诱导分化

不同类型的MSCs需要不同的诱导方案及诱导培养基。此类文献甚多，诱导方案不同，诱导周期也从几天至几十天不等，目前尚无统一标准，但许多小分子化合物已经被证实在MSCs的诱导分化中起重要作用，可以把它们称之为胰岛素刺激因子，包括EGF、bFGF、activin A、β-cellulin、nicotinamide、exendin-4、HGF、pentagastrin等。其中，EGF在细胞增殖、分化、存活中都起着重要作用，bFGF则增加细胞生长和细胞迁移，参与体内的新生血管形成，是胰腺的细胞簇形成最有效趋化因子。高浓度EGF及bFGF无论是单独或组合使用，均能促进IPCs簇的形成。β-cellulin通过刺激未分化胰腺上皮细胞的有丝分裂，增加胰岛细胞簇的数量。activin A能够增加细胞胰岛素合成量。尼克酰胺能保持胰岛细胞活力和功能，通过其主要的代谢产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)起作用。exendin- 4能够刺激β细胞的增殖和新生，促进不同组织起源的干细胞分化为IPCs[9]。HGF能够促进细胞增殖、增加细胞运动和细胞形态变化，并能增加体外培养人胰岛细胞的数量。

葡萄糖的浓度在IPCs分化中起重要作用，葡萄糖浓度较低时可增加胰岛簇的胰岛素分泌量，浓度较高时则能促进β细胞的增殖，因此，在诱导过程中常常需要改变葡萄糖的浓度来促进细胞的增殖，增加胰岛素分泌。同样，血清的撤退有利于细胞分化形成胰岛样簇。因此，在诱导的早期通常是无血清阶段。

MSCs在受胰岛素刺激因子诱导后，开始表达胰腺及胰岛发育相关基因，如GLUT-2、萄糖激酶、胰岛淀粉样多肽、巢蛋白、Pdx-1、Pax-6，并合成C-肽和胰岛素，这些已经被证明在胰腺和/或胰岛分化成胰岛β细胞的过程中发挥作用。尽管上述胰岛β细胞的分化中的转录因子已被发现，但是关于它们的功能及具体分子机制尚未可知，且大部分胰岛素刺激因子在胰岛β细胞的分化中是顺序及瞬时表达，这要求在体外环境下MSCs诱导分化IPCs的过程应该至少遵循其中主要的转录过程。

尽管诱导机制尚未完全阐明，许多研究者通过不同的诱导分案分别将BM-MSCs[10-11]、UCB-MSCs[12-13]、AD-MSCs[14-15]、UC-MSCs[16]成功诱导为IPCs，形成类似胰岛的集落，并证实可对葡萄糖反应产生胰岛素。

4 糖尿病小鼠模型及动物试验

在MSCs进入人体应用之前，动物试验的数据及分析是必不可少的。大多数学者所选用的糖尿病小鼠模型主要分为两种： (1)NOD/SCID小鼠；(2) 链 脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)注射法造模。NOD/SCID小鼠是T和B淋巴细胞严重缺乏具有免疫缺陷的T1DM小鼠，发病具有显著的性别差异，饲养30周的雌鼠发病率可达90%～100%。STZ能够选择性破坏小鼠及大鼠的胰岛β细胞，诱发糖尿病，大剂量注射时，可引起胰岛β细胞的广泛性破坏，造成类似T1DM的动物模型；而注射小剂量STZ时，由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不敏感，同时给予高脂高热量饲料喂养，两者结合便诱导出接近于人类T2DM的动物模型。有研究者用源于UCB-MSCs[17]、UC-MSCs[18]、AD-MSCs[19-21]及BM-MSCs[22-23]单独或者联合造血干细胞(hematopoietic stem cells， HSCs)的IPCs移植治疗糖尿病小鼠，试验结果令人鼓舞，小鼠血糖明显下降，胰岛素表达量增加，胰岛及周围血管再生增加，器官组织切片染色发现移植区出现胰岛类团簇，胰岛素染色阳性。

5 MSCs及IPCs在人体的应用

2008年，Trivedi等[24]报道了将AD-MSCs体外诱导分化为IPCs并联合造血干细胞移植到5名糖尿病患者的门静脉内，因肝脏是最易发生免疫耐受的器官。结果表明所有患者可降低30%～50%的胰岛素需要量，血清C肽水平提高4～26倍，并且在平均2.9个月的随访期内所有患者未发生任何不良反应，也未采取任何免疫抑制治疗。2010年，Vanikar等[25]公布了AD-MSCs诱导IPCs联合造血干细胞移植治疗11名糖尿病患者的研究结果。报告显示体外分化的IPCs可以分泌产生胰腺和(或)胰岛相关的转录因子，如Pax6、Isl1、Pdx1等，联合造血干细胞移植患者体内后随访。在平均23个月的随访期内，患者表现出胰岛素依赖量下降，糖化血红蛋白下降，血清C肽量明显提高，无1例患者出现糖尿病酮症酸中毒，且未发生免疫排斥反应，患者饮食恢复至正常。后有研究者陆续采用MSCs及IPCs治疗糖尿病患者，效果较为满意，但由于社会伦理及其他方面的限制，MSCs的治疗始终无法大规模采用，临床样本不足。

6 展 望

综上来看，干细胞移植似乎是目前治疗糖尿病的理想方法。但是，由于MSCs定向诱导分化机制的尚未完全阐明，T1DM及T2DM发病机制的复杂多样，目前的研究虽然取得一定的进展，待解决的问题仍然很多，MSCs定向分化机制尚未阐明，如何提高诱导效率也是当下的难题，与治疗相关的细胞移植数量、时间及途径也没有统一的标准，体内可控性和安全性尚需要进一步探讨。

最后，如何提高MSCs及IPCs移植体内后的存活率也是待解决的重要课题之一。当然，随着细胞基因工程的迅速发展，一些新的思路也运用到干细胞治疗中，将某些促进血管新生的基因导入干细胞内使其过表达，不仅有助于MSCs及IPCs在体内的定植及存活，而且有助于受体胰岛的血管修复及胰岛再生。

相信随着研究的深入进展，新技术、新方法的合理应用，MSCs必将在糖尿病的治疗中占据一席之地。

[1] Xu Y, Wang L, He J, et al. Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J]. JAMA, 2013,310(9)： 948-959.

[2] Schatz D, Gale EA, Atkinson MA. Why can’t we prevent type 1 diabetes? Maybe it’s time to try a different combination[J]. Diabetes Care, 2003，26： 3326-3328.

[3] Leahy JL, Weir GC. Beta-cell dysfunction in hyperglycaemic rat models： recovery of glucose-induced insulin secretion with lowering of the ambient glucose level[J]. Diabetologia, 1991,34(9)： 640-647.

[4] Assady S, Maor G, Amit M, et al. Insulin production by human embryonic stem cells[J]. Diabetes, 2001,50(8)： 1691-1697.

[5] Furth ME, Atala A. Stem cell sources to treat diabetes[J]. J Cell Biochem, 2009,106(4)： 507-511.

[6] Todd JA. Stem cells and a cure for type 1 diabetes?[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 2009,106(37)： 15523-15524.

[7] Erol Cemsi.胰岛素生成,胰岛素分泌及2型糖尿病： 问题的核心在于β细胞[J].中华内分泌代谢杂志,2005,21(3)： 194-198.

[8] 赵家伟,马凤海,罗梅,等.胰岛β细胞胰岛素抵抗的证据[J].中华内分泌代谢杂志,2006,21(4)： 408-409.

[9] Li H, Lam A, Xu AM, et al. High dosage of Exendin-4 increased early insulin secretion in differentiated beta cells from mouse embryonic stem cells[J].Acta Pharmacol Sin, 2010，31(5)： 570-577.

[10] Wu XH, Liu CP, Xu KF, et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic rats by portal vein transplantation of islet-like cells generated from bone marrow mesenchymal stem cells[J]. World J Gastroenterol, 2007,13(24)： 3342-3349.

[11] Karnieli O, Izhar-Prato Y, Bulvik S, et al.Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation[J].Stem Cells, 2007,25(11)： 2837-2844.

[12] Hu YH, Wu DQ, Gao F, et al. A secretory function of human insulin-producing cellsinvivo[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2009,8(3)： 255-260.

[13] Chao KC, Chao KF, Fu YS, et al. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton’s Jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes[J]. PLoS One, 2008,3(1)： e1451.

[14] Okura H, Komoda H, Fumimoto Y, et al. Transdifferentiation of human adipose tissue-derived stromal cells into insulin-producing clusters[J]. J Artif Organs, 2009,12(2)： 123-130.

[15] Dave SD, Vanikar AV, Trivedi HL. Ex vivo generation of glucose sensitive insulin secreting mesenchymal stem cells derived from human adipose tissue[J]. Indian J Endocrinol Metab, 2012,16(S1)： S65-69.

[16] Boroujeni ZN, Aleyasin A. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells can secrete insulin in vitro andinvivo[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2014,61(2)： 82-92.

[17] Ende N, Chen R, Reddi AS. Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulitis in type 1 diabetic mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,325(3)： 665-669.

[18] Chao KC, Chao KF, Fu YS, et al. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton’s Jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes[J]. PLoS One, 2008,3(1)： e1451.

[19] Abu-Abeeleh M, Ismail ZB, Alzaben K, et al. A preliminary study of the use of human adipose tissue-derived stem cells for the treatment of streptozotocin-induced diabetes mellitus in a rat model[J]. Comparat Clin Pathol, 2010,19(1)： 1-4.

[20] Lin G, Wang G, Liu G, et al. Treatment of type 1 diabetes with adipose tissue-derived stem cells expressing pancreatic duodenal homeobox 1[J]. Stem Cells Dev, 2009,18(10)： 1399-1406.

[21] Chandra V, Swetha G, Muthyala S, et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice[J]. PLoS One, 2011,6(6)： e20615.

[22] Urban VS, Kiss J, Kovacs J, et al. Mesenchymal stem cells cooperate with bone marrow cells in therapy of diabetes[J]. Stem Cells, 2008,26(1)： 244-253.

[23] Ezquer FE, Ezquer ME, Parrau DB, et al. Systemic administration of multipotent mesenchymal stromal cells reverts hyperglycemia and prevents nephropathy in type 1 diabetic mice[J]. Biol Blood Marrow Transplant, 2008,14(6)： 631-640.

[24] Trivedi HL, Vanikar AV, Thakker U, et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells combined with hematopoietic stem cell transplantation synthesize insulin[J] Transplant Proc, 2008,40(4)： 1135-1139.

[25] Vanikar AV, Dave SD, Thakkar UG, et al. Cotransplantation of adipose tissue-derived insulin-secreting mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells： a novel therapy for insulin-dependent diabetes mellitus[J]. Stem Cells Int, 2010,2010： 582383.

Research Progress on Mesenchymal Stem Cells Transplantation for Treatment of Diabetes Mellitus

XUCheng-lei,SONGZhen-shun

(Dept. of Hepatopancreatobiliary Surgery, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Diabetes mellitus, especially type 1 diabetes mellitus (T1DM), is largely related to an innate defect in the immune system, resulting in the destruction of islet β cells and insulin inadequate secretion due to autoimmune attack. There is no effective method to cure diabetes at present. Mesenchymal stem cells (MSCs) have powerful capabilities of proliferation and differentiation, and offer a promising possibility for novel therapy. MSCs’ potential of transdifferentiation into insulin-secreting cells (IPCs)invitroshow us a stimulating inspiration. This review introduce a new approach of MSCs-derived IPCs, as a potential therapeutic benefit for T1DM in experimental animal models as well as in human studies.

mesenchymal stem cells; diabetes mellitus; differentiation; insulin-producing cells

10.16118/j.1008-0392.2016.05.027

2015-05-28

国家自然科学基金(81170436)

徐承雷(1990—)，男，硕士研究生.E-mail： a402101086@163.com

宋振顺.E-mail： zs_song@hotmail.com

R 587.1

A

1008-0392(2016)05-0128-05