线粒体DNA突变与遗传性聋*

王芳综述 刘星辰郭玉芬审校

·综述·

线粒体DNA突变与遗传性聋*

王芳1综述 刘星辰1郭玉芬1审校

遗传性聋是临床上最常见的先天性疾病之一，目前，全世界范围内约有3.6亿耳聋患者，其在发达国家新生儿中的发病率约为3‰［1］。耳聋可以由基因突变和环境因素（包括耳毒性的氨基糖苷类抗生素的应用）造成。遗传性聋分为非综合征型聋（non－syndromic hearing loss，NSHL）和综合征型聋（syndromic hearing loss，SHL），线粒体DNA突变是造成遗传性聋的一个重要原因；研究表明线粒体DNA突变与母系遗传NSHL和SHL相关［2，3］。线粒体DNA12Sr RNA与t RNA突变是引起遗传性聋的两个常见基因突变类型，位于线粒体12Sr RNA基因高度保守区域上的1555A＞G和1494C＞T突变类型已被证明与氨基糖苷类抗生素造成的耳毒性聋（aminoglycoside antibiotic induced deafness，AAID）或NSHL有关。大部分的t RNA突变与SHL相关，而位于t RNASer（UCN）上的A7445G、7472insC、T7505C、T7510C和T7511C等突变类型与NSHL关系密切。现就线粒体DNA突变导致耳聋的机制及相关临床表型综述如下。

1 线粒体DNA（mt DNA）

线粒体（mitochondrial）是为细胞提供能量（ATP）的细胞器，拥有自身的遗传物质和遗传体系，一般情况下，一个线粒体中含有多个DNA分子，它们携带着自己的DNA——mtDNA。mtDNA位于线粒体内膜和基质，为共价闭环的双链分子，分子量为107 Daltons；mt DNA虽能合成蛋白质，但其种类十分有限，1981年，Anderson等［4］测定了人类mt DNA全长序列，mt DNA编码的RNA和多肽有线粒体核糖体中2种r RNA（12S及16S）、22种t RNA、13种多肽（每种约含50个氨基酸残基），这些在线粒体蛋白质的合成过程中起重要作用。

2 mtDNA 突变与遗传性聋

mt DNA突变具有阈值效应，即：当DNA突变超过一定量，野生型mt DNA的数量减少到足以影响线粒体氧化磷酸化的功能时，机体组织或器官就会出现某种异常表型［5］。由此可见，阈值效应和该组织器官对氧化磷酸化的依赖程度有关，如：脑、骨骼肌、心脏、肝脏等能量需求高的组织更易受mt DNA突变的影响。由于mt DNA是临近活性氧产生站点且线粒体有相对不完善的DNA保护和修复系统，因此mt DNA有较高的突变率。除红细胞外，人身体的其他细胞内均含有线粒体，但线粒体基因只能随女性的卵子遗传给下一代，即母系遗传。1988年，Wallace等［6］发现了由mt DNA突变所引起的Leber遗传性视神经眼病，首次证实mt DNA突变可引起人类疾病，迄今为止，mt DNA突变致聋机制的研究仍是线粒体疾病领域的研究热点之一。众所周知，在耳蜗的支持细胞、外毛细胞和血管纹中均含有大量的线粒体，特别是在耳蜗底回的外毛细胞中线粒体的数目更多，线粒体产生的ATP对耳蜗内声音的转换、外毛细胞对基底膜的调节及毛细胞与内淋巴之间的离子平衡有重要作用；与此同时，线粒体还会产生大量的氧自由基（reactive oxygen species，ROS）［7］，正常情况下，ROS可被抗氧化酶清除，耳蜗细胞对氧化磷酸化的要求较高，若线粒体功能异常，ROS的产生量会进一步增加，从而介导细胞氧化应激机制，损伤内耳毛细胞，造成内淋巴循环及毛细胞内离子浓度失衡，导致毛细胞逐渐萎缩、死亡，直至永久性的听力丧失。

2.1 mtDNA12Sr RNA突变与遗传性聋 mtDNA12Sr RNA基因突变可以引起SHL和NSHL，但目前的报道中，线粒体DNA12Sr RNA基因突变导致SHL的病例较少，而与AAID和NSHL的关系非常密切。目前，国内外在mt DNA突变与遗传性聋方面研究最多的是mt DNA12Sr RNA基因上的1555A＞G和1494C＞T突变类型，除此之外还有96linsC、1095T＞C、961T＞C、1291T＞C等突变类型。

2.1.1 mtDNA12Sr RNA A1555G突变 mtDNA12Sr RNA A1555G是第一个被确定的NSHL线粒体突变类型，在非洲和美国NSHL人群中mt DNA12Sr RNA A1555G突变检出率为1%和0.6%［8，9］，在日本和中国NSHL人群中其检出率为3.45%和2.83%［10，11］，而在印度尼西亚，mt DNA12Sr RNA A1555G检出率高达5.3%［12］；由此可见，在不同的种族、地区之间mt DNA12Sr RNA A1555G检出率不同。目前，该基因突变致聋的机制已明确，A1555G位于氨酰t RNA核糖体小亚基的受体位点（A位点），这是一高度保守的区域，该突变使得mt DNA12Sr RNA上的第1494和1555两个位点形成新的碱基对（C1494－1555G），形成与氨基糖苷类药物结合的位点，从而影响线粒体蛋白质的合成而导致药物性聋［13］。听力损失通常发生在使用过氨基糖苷类药物后的3天到3个月左右，临床表现通常为双侧、重度或极重度且不可逆的高频听力损失。后来，Matsunage等［14］在一些未使用氨基糖苷类药物的耳聋家系研究中也发现了mtDNA12Sr RNA A1555G突变，认为其致聋机制是该突变使转甲基酶mt－TFB1催化的mtDNA12Sr RNA的甲基化增强，线粒体发生应激反应，启动了E2F1凋亡信号，进而导致耳聋［15］；在该基因突变人群中，其临床表型（听力损失程度、耳聋外显率、发病年龄）存在很大差异，听力损失呈现迟发性、渐进性发展趋势，这些差异可能与线粒体本身、外界环境因素及核修饰基因有关［16］。2002年，Merales等［17］对6个携带12Sr RNA A1555G突变的大家系中的55例患者进行研究，发现未使用氨基糖苷类药物的耳聋患者听力损失多表现为迟发性轻度至中度感音神经性聋，17例使用氨基糖苷类药物的患者则多表现为重度听力损失；可见，氨基糖苷类药物对mtDNA12Sr RNA A1555G突变患者的耳聋具有诱发或加重作用。

2.1.2 mtDNA12Sr RNA C1494T突变 mtDNA12Sr RNA C1494T突变是在12Sr RNA高度保守的区域形成与A1555G突变结构类似的新的碱基对（U1494－1555A），导致mt DNA12Sr RNA的二级结构和大肠杆菌mtDNA 16Sr RNA结构类似，从而形成高敏的氨基糖苷类药物结合位点。2004年，Zhao等［18］在中国的一个大家系中首次发现了与药物性聋关系密切的mt DNA12Sr RNA C1494T突变，并阐明其耳聋表型通常为语后聋或者药物性聋。Wang等［19］在有氨基糖苷类药物应用史的耳聋患者中也发现了mtDNA12Sr RNA C1494T突变，该突变导致的耳聋临床表型以高频听力下降为主，呈双侧对称性的感音神经性聋，听力损失程度从轻度到极重度不等，可能与核基因的调控有关。有研究表明，随着母系遗传的发生，此突变位点造成的耳聋患者的发病年龄会逐渐提前［20］。

2.1.3 mtDNA12Sr RNA A827G突变 A827位于12Sr RNA高度保守的氨酰基结合部位，具有较高的流行率，A→G的突变改变了12Sr RNA的三级或四级结构，使其易于和氨基糖苷类药物结合，从而影响线粒体蛋白质的合成而造成听力下降［21］。2005年，Li等［22］首次在AAID及NSHL患者家系中发现了mtDNA12Sr RNA A827G突变。有研究证明，在mt DNA12Sr RNA A827G突变致聋的各家系以及同一家系的不同个体之间，临床表型存在很大的差异（听力损失从正常到重度不等）［23］，表明该基因突变是致聋的主要分子基础，但是单纯的mtDNA12Sr RNA A827G突变却不足以致聋，显然，氨基糖苷类药物是激发其致聋的重要因素。然而，有学者在未使用氨基糖苷类药物的母系遗传家系中仍发现了mtDNA12Sr RNA A827G突变，呈现为先天性或婴幼儿期发病，临床表型为双耳对称的重度至极重度的感音神经性聋［24］。

2.1.4 mt DNA12Sr RNA 961突变 961位点位于12Sr RNA基因第loop21、loop22之间的C碱基簇，其突变在AAID、NSHL家系及散发患者中被发现，可以出现多种突变形式。1995年，Bacino等［25］发现了961del T／insC（n）：T缺失和数目不等的C嵌入；2002年，Tang等［26］在高加索人和亚洲人中发现了961insC：一个单一的T缺失，插入了一个与之不同的C；2004年，Li等［9］在中国家系中发现了961T＞G，随后，又发现了961T＞C。与mt DNA12Sr RNA A1555G等突变机制不同的是，mtDNA12Sr RNA 961突变区域并不是12Sr RNA基因上高度保守区域，其功能目前尚未明确，特别是其与氨基糖苷类药物的相互作用机制还需进一步研究。

2.2 线粒体tRNA突变与遗传性聋 mtDNA共编码22种t RNA，其中轻链编码Ser（UNC）、Glu、Cys、Ala、Asn、Tyr、Gln和Pro，重链编码Phe、Val、Leu（CUN）、Ile、Leu（UUR）、Met、Gly、Ser（AGY）、Trp、Arg、Asp、Lys、His和Thr。tRNA携带氨基酸指导蛋白质的合成，t RNA含有较多的错配和G－U配对，具有高度保守性，对于维持t RNA的稳定性和特异性具有重要意义。t RNA突变可引起NSHL和SHL，与NSHL相关的t RNA突变具有典型的组织特异性，与SHL相关的线粒体t RNA突变多为异质性突变，tRNA突变可分为原发性突变（突变可直接造成耳聋的发生）与继发性突变（单一突变不足以致聋，对原发性突变有修饰作用）［27］。

2.2.1 线粒体t RNASer（UNC）突变与遗传性聋 t RNASer（UNC）是耳聋的基因突变机制中的热点突变，目前研究发现，线粒体t RNASer（UNC）基因突变与NSHL关系密切，包括A7445G、7472insC、7505T＞C、7510T＞C、7511T＞C等，这些突变常常是同质性或高度异质性［28］，研究认为，这些基因的突变会导致t RNA的代谢功能衰竭，改变线粒体的呼吸作用，逐渐引起毛细胞的萎缩，甚至凋亡，从而造成NSHL［29］。

1995年，Fischel－Ghodsian等［30］首先在一个苏格兰家系中发现了t RNASer（UCN）A7445G突变，在结构上，这种突变造成mtDNA H链上编码细胞色素氧化酶亚基I（COI）的终止密码子AGA被替换为AGG，然而，A7445G突变对COI表达无影响［31］。因此认为，这种突变未改变t RNASer（UCN）的结构，但影响t RNASer（UCN）前体的处理速度，导致了t RNASer（UCN）的级别降低及ND6 mRNA和蛋白质量的合成显著减少。A7445G经常呈现出低外显率，在母系遗传家系中，携带同一突变的患者，其听力损失程度、发病年龄、耳聋外显率具有可变性，主要表现为渐进性听力下降［32］；亦有研究报道，携带A7445G突变的患者表现为正常听力［33］。

2.2.2 线粒体t RNALeu（UUR）突变与遗传性聋A3243G位于线粒体tRNA的高度保守序列，其突变常以异质性存在，可影响t RNALeu（UUR）的高级结构以及线粒体核糖核酸前体的处理，最终影响氨酰化t RNA与核糖体的结合。当细胞中A3243G突变占70%以上时，将导致严重的线粒体疾病，如线粒体脑肌病伴卒中样发作及乳酸血症（mitochondrial encephalopathy lactic acidosis and strokeliked episodes，MELAS）和肌阵挛样发作伴破碎红纤维（myoclonus epilepsy with ragged red fibers，MERRF）等，而当该突变型低于30%时则表现为母系遗传性糖尿病伴耳聋（maternally inherited diabetes mellitus and deafness，MIDD），听力损失以高频听力下降为主［34］。

2.2.3 线粒体t RNAHis突变与遗传性聋T12201C突变破坏了线粒体tRNAHis二级结构受体臂上高度保守的碱基对（5A－68U），从而影响t RNAHis的稳态水平及氨酰化，导致线粒体蛋白合成及氧消耗率下降，ATP产量降低，ROS生成随之增加，最终导致内耳功能障碍［35］。2011年，Yan等［36］在一个中国大家系中首次检测出了T12201C异质性突变，与其他异质性mtDNA突变导致SHL相比，T12201C突变导致迟发性NSHL。T12201C突变的患者中约80%为重度听力损失，它导致的母系遗传中迟发性及重度听力损失可能是由于耳蜗细胞中T12201C突变积累所致；值得注意的是，在细胞中，T12201C异质性突变水平与听力损失的严重程度相关［37］。

3 核修饰基因在线粒体遗传性聋中的作用

mtDNA独立存在于核染色体基因组之外，但受核基因的调控。上文已述及，在已知由线粒体基因突变导致的耳聋患者中，临床表型异质性可能与核修饰基因的调控相关，Guan等［38］通过对携带mtDNA A1555G的耳聋家系进行淋巴细胞永生化来分析线粒体功能，结果表明，在同一家系母系成员中，核基因背景不同时，临床表型异质性较大，之后Guan将此淋巴细胞系与P°206细胞融合，使核基因背景一致后，患者之间的临床表型异质性明显减小，由此证明了核基因在耳聋患者临床表型中具有调控作用。核基因对线粒体基因的修饰作用在于改变mt DNA的结构、影响mt DNA结构的稳定性及影响线粒体的分离方式三个方面［39］。随后采用家系连锁分析的方法定位影响线粒体耳聋表型表达的MTO1、GTPBP3、TFB1M和TRMU四个候选核修饰基因［40～42］，但是其在线粒体耳聋临床表型上的调控机制却非常复杂，仍处于探索阶段。

4 总结与展望

本文综述了部分mtDNA突变与遗传性聋相关性的研究进展，但目前，由于DNA突变率高、检测方法复杂、成本高昂等原因，国内外对mtDNA突变引起耳聋的研究甚少，在我国，针对mt DNA的检测大部分仍局限于12Sr RNA A1555G和C1494T两个位点，对其致聋的分子机制已有了明确的认识，而对tRNA所知甚少，这远不足以为耳聋患者寻找致病原因。另外，线粒体遗传性聋患者临床表型往往不一，单纯的mtDNA突变尚不足以造成耳聋的表型，线粒体本身、外界环境因素及核修饰基因对临床表型的具体作用仍需要进行深入的研究。目前，发现新的致聋基因成为研究的重点方向，耳聋基因的诊断方法有：基因测序、变性高效液相色谱（DHPLC）分析、高分辨率熔解（HRM）曲线分析、单链构象多态性分析、基因诊断芯片和限制性酶切等，以基因测序为金标准。传统的Sanger测序技术对于发现新的突变位点具有重要意义，但存在操作繁琐、成本高、通量低、不适用于大规模测序等缺陷。目前的新一代测序技术（Solexa测序技术、454测序技术和SOLiD测序技术）是一种低成本、高通量、高效率的检测技术，已广泛应用于耳聋基因的研究中。未来，人们将对遗传性聋的新的致病基因及致病机制进行更深刻细致的研究，为产前诊断、遗传咨询、基因治疗等提供帮助。

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（2015－12－28收稿）

（本文编辑 李翠娥）

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.022

时间：2016－6－29 16：14

R764.44

A

1006－7299（2016）04－0405－05

* 国家自然基金资助项目（81570926）

1 甘肃省兰州大学第二医院耳鼻咽喉头颈外科（兰州 75300）

郭玉芬（Email：gyflhmm＠163.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1614.048.html