温阳活血法对寒凝血瘀证荷CT-26小鼠肺组织MMPs及ERK的影响

唐朋林郭 勇

温阳活血法对寒凝血瘀证荷CT-26小鼠肺组织MMPs及ERK的影响

唐朋林1郭 勇2

目的观察寒凝血瘀状态及温阳活血法对肿瘤转移靶组织微环境的影响。方法建立寒凝血瘀证荷瘤小鼠复合动物模型。将48只Balb/c小鼠随机分为空白对照组、单纯荷瘤组、寒凝血瘀荷瘤组、温阳活血治疗组，每组12只，分别造模，Western blot方法检测各组小鼠肺组织MMPs及ERK的表达。结果与单纯荷瘤组比较，寒凝血瘀荷瘤组小鼠ERK1/2、MMP-2表达均升高[ERK1/ 2 RI值：（1.40±0.01）比（0.98±0.03），P＜0.05]；[MMP-2 RI值：（1.26±0.05）比（1.00±0.04），P＜0.05]；与寒凝血瘀荷瘤组比较，温阳活血治疗组小鼠ERK1/2、MMP-2表达均降低 [ERK1/2 RI值：（1.18± 0.01）比（1.40±0.01），P＜0.05]；[MMP-2 RI值：（1.01±0.05）比（1.26±0.05），P＜0.01]。与寒凝血瘀荷瘤组比较，温阳活血治疗组小鼠MMP-12表达升高[MMP-12 RI值：（1.23±0.03）比（1.08±0.06）（P＜0.05）]。结论温阳活血法通过下调荷瘤小鼠肿瘤转移靶器官肺组织ERK1/2、MMP-2表达及上调MMP-12从而影响肿瘤基质及肿瘤血管生成，进而减少转移灶形成的发生率。

小鼠；荷CT-26结肠腺癌细胞；寒凝血瘀证；温阳活血法；MMP-2；MMP-12；ERK1/2

转移和侵袭是恶性肿瘤的基本生物学特征，控制转移是决定肿瘤患者预后的关键因素。肿瘤转移是宿主、肿瘤细胞与肿瘤微环境之间多因素相互作

用的复杂过程。允许肿瘤生长的转移靶组织微环境变化活化先于癌细胞转移，为肿瘤向该组织转移提供有利条件。中医理论解读肿瘤的发生与发展也是机体内环境诸多阴阳平衡被打破的恶性循环的过程[1]，这与肿瘤转移微环境的理论不谋而合。根据辨证论治原则，针对肿瘤患者不同证候类型施以不同治则治法，以期恢复机体内环境平衡，达到降低肿瘤转移发生率。血瘀证是恶性肿瘤患者的主要证候之一，“寒”是肿瘤晚期患者的又一特点，寒凝血瘀为血瘀证常见亚型之一[2]。肺组织是肿瘤转移常见的靶器官，这可能与肺组织中毛细血管密集，为肿瘤细胞的增殖提供便利条件，并且大量的肺泡巨噬细胞分泌多种细胞因子，促进细胞运动、侵袭及新生血管生成有关。本研究从肿瘤新生血管与肿瘤细胞降解细胞基底膜及细胞外基质方面着手，通过检测转移靶器官肺组织中MMP-2、MMP-12、ERK1/2的表达以分析寒凝血瘀状态及温阳活血法对肿瘤转移的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康8周龄雌性Balb/c小鼠48只，体质量（20±2）g，由中国医学科学院上海实验动物中心提供，合格证号：上海西普尔-必凯实验动物有限公司SCXK（沪）2008-0016。SPF条件下饲养于浙江中医药大学动物实验中心B区：温度（24±2）℃，湿度（55±5）%，噪音＜50db，每12h予亮暗循环，2周更换1次敷料，用无菌营养颗粒饲料饲养。

1.2 实验瘤株 小鼠结肠腺癌细胞CT-26 colon cancer，购自上海细胞库。

1.3 药物及主要试剂 0.9%NaCl（常州康普药业有限公司，批号0905025）；0.1%盐酸肾上腺素（天津金耀氨基酸有限公司，批号H12020526）；Tris、Triton X-100（ANDYBOY公司）；过硫酸铵（爱建德固赛引发剂有限公司）；丙烯酰胺（Bio-Rad公司）；十二烷基磺酸钠（AMRESCO公司）；Tween20、Temed（Bio-Rad公司）；Marker（Ferment公司）甘氨酸（AMRESCO公司）；化学发光试剂A、B（Millipore Corparation公司）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（Santa Cruz公司）；兔抗MMP-2一抗、兔抗MMP-12一抗（Epitomics公司）；兔抗ERK1/2、兔抗pERK1/2、鼠抗β-actin一抗（CST公司）；RIPA细胞裂解液（Roch公司）；RMPI-1640培养基、DMEM培养基（GIBCO公司）；0.4%台盼兰溶液、Brij-35（AMRESCO公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；0.25%胰酶-EDTA（吉诺生物医药技术有限公司）；蛋白定量试剂盒A、B（Bio-rad公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组 应用计算机生成的随机数字表将48只8周龄Balb/c小鼠随机分为四组：空白对照组、单纯荷瘤组、寒凝血瘀荷瘤组、温阳活血治疗组，每组12只。

2.2 造模方法 （1）空白对照组：每天定点小鼠皮下静脉注射无热源生理盐水0.2mL,隔天1次,连续2周。2周后复予皮下注射无热源生理盐水0.2mL，隔天1次，连续4周。（2）单纯荷瘤组：每天定点小鼠皮下静脉注射生理盐水0.2mL,隔天1次,连续2周。2周后每只小鼠右前肢腋部皮下接种C26单细胞悬液（密度=4×106个/mL）0.2mL。24h后复予皮下注射无热源生理盐水0.2mL，隔天1次，连续4周。（3）寒凝血瘀荷瘤组：每天定点小鼠皮下注射0.1%肾上腺素0.08mL/kg（用生理盐水稀释到0.2mL），分两次注射，第1次注射后1h，进行冰浴（4～6℃）4min，连续2周，2周后每只小鼠右前肢腋部皮下接种C26单细胞悬液（密度=4×106个/mL）0.1mL。皮下接种24h后维持造模，隔天1次，连续4周。（4）温阳活血治疗组：同寒凝血瘀荷瘤组。

2.3 中药干预 中药煎剂选用温阳活血代表方剂血府逐瘀汤合当归四逆汤加减（桃仁、红花、川芎各12g，生地15g，赤芍、牛膝、柴胡各12g，枳壳6g，桔梗12g，当归 15g，桂枝 12g，芍药 15g，甘草 6g，大枣15g）。原生药材购自浙江中医药大学制剂室，按传统工艺将药物加水反复浓煎，浓缩至生药含量为1.68g/ mL浓度的中药水煎剂，密封，4°C保存，临用前稀释。温阳活血治疗组小鼠瘤体接种24h后开始中药灌胃，药量换算方法以陈奇推荐的换算法[3]为依据，根据成人每天每60kg体质量药量的10倍推算出等效剂量0.28g/（10g·d）按比例稀释至0.2mL中药煎剂灌胃，每天1次，连续4周。

2.4 动物观察 参照相关文献[4-7]评价小鼠寒凝血瘀证模型，动物模型寒凝血瘀证候的相关观测指标包括：一般情况（外在症状、体温、毛发情况、耳廓毛细血管网外观）、实验室指标（全血黏度、局部微血管血流值）。瘤体接种观察：造模第2周瘤细胞皮下接种后每天观察各组荷瘤小鼠瘤体大小。

2.5 标本采集及检测 于造模第42天通过微循环多普勒仪器检测各组小鼠耳朵、脚趾、腹部血管的血流值，每只小鼠取血送检全血黏度，然后采用颈椎脱臼法处死各组小鼠，解剖并取出全部肺组织，固定于10%福尔马林，部分肺组织HE染色；部分肺组织采用Western blot检测MMP-2、MMP-12、pERK1/2蛋白浓度。

2.6 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件分析处理。依各数据类型分别采用方差分析（F检验、多样本均数间多重比较的Dunnett-t检验及LSD-t检验），率的比较用χ2检验。计量资料数据用均数±标准差（±s） 表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 模型评价 单纯荷瘤组、寒凝血瘀荷瘤组、温阳活血治疗组小鼠右前肢腋部皮下接种C26单细胞悬液1周左右后接种部位出现位置固定、质地稍软的实体肿块，随后肿瘤结节逐渐增大，荷瘤小鼠皮下移植瘤接种成功率为100%（36/36）。除空白对照组小鼠外，各组小鼠均有消瘦及被毛脱落、动作迟缓等症状；寒凝血瘀荷瘤组、温阳活血治疗组小鼠在造模开始后出现畏寒喜暖,食少便稀,倦缩少动，毛发变黄、枯槁，双眼球颜色变暗红，爪甲逐渐紫暗，耳缘毛细血管颜色由红逐渐变深红甚至紫红等寒凝血瘀证症状，空白对照组及单纯荷瘤组小鼠无寒凝血瘀证典型表现。寒凝血瘀荷瘤组、温阳活血治疗组各小鼠的耳缘血管、脚趾及腹壁静脉所测得血流值均小于空白对照组及单纯荷瘤组小鼠，见表1，血黏度值检测明显高于空白对照组及单纯荷瘤组小鼠，见表2，提示寒凝血瘀荷瘤组、温阳活血治疗组各小鼠血液处于高黏滞状态,结合寒凝血瘀证典型表现说明本研究小鼠寒凝血瘀证模型建立成功。

表1 各组小鼠局部微循环血流量（±s）

表1 各组小鼠局部微循环血流量（±s）

注：与单纯荷瘤组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别空白对照组单纯荷瘤组寒凝血瘀荷瘤组温阳活血治疗组只数12 12 12 12耳缘42.9±2.78 35.6±5.1 33.8±3.2** 35.0±5.8*脚趾49.4±8.17 33.4±1.9 29.6±1.4* 32.7±2.1*腹壁95.1±9.8 74.0±4.0 64.0±5.4** 69.9±13.0*

表2 各组小鼠全血黏度比较（mps.s，±s）

表2 各组小鼠全血黏度比较（mps.s，±s）

注：与单纯荷瘤组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别空白对照组单纯荷瘤组寒凝血瘀荷瘤组温阳活血治疗组只数12 12 12 12低切27.66±1.0 35.61±1.1 48.87±1.8* 44.40±2.0*中切5.70±0.40 6.61±0.55 8.25±2.75* 7.68±0.55*高切3.07±0.29 4.89±0.27 7.04±1.40** 5.22±0.18*

3.2 各组小鼠免疫组化检测结果 48只雌性Balb/c小鼠的肺脏进行免疫组化检测及HE染色，病理切片上均未发现C26细胞转移灶，亦未发现异常血管生成、肿瘤原发灶及其它癌前病变。

3.3 各组小鼠Western blot结果 与单纯荷瘤组小鼠比较，寒凝血瘀荷瘤组MMP-2（P＜0.05），pERK1/2表达升高（P＜0.05）。与寒凝血瘀荷瘤组小鼠比较，温阳活血治疗组小鼠MMP-2表达降低（P＜0.01），pERK1/2表达降低（P＜0.05）。与单纯荷瘤组小鼠比较，寒凝血瘀荷瘤组小鼠MMP-12表达升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与寒凝血瘀荷瘤组比较，温阳活血治疗组小鼠MMP-12表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组小鼠RI值比较（±s）

表3 各组小鼠RI值比较（±s）

注：与单纯荷瘤组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与寒凝血瘀荷瘤组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别空白对照组单纯荷瘤组寒凝血瘀荷瘤组温阳活血治疗组只数12 12 12 12 MMP-2 0.67±0.06 1.00±0.04 1.26±0.05* 1.01±0.05△△pERK1/2 0.73±0.01 0.98±0.03 1.40±0.01* 1.18±0.01△MMP-12 0.69±0.03 0.66±0.06 1.08±0.06 1.23±0.03△

4 讨 论

早在1889年，Paget提出器官微环境（“土壤”）可影响特定肿瘤细胞（“种子”）的种植、侵袭、存活、生长，肿瘤转移早期常呈现特异脏器亲合性，允许肿瘤生长的原发肿瘤器官及转移器官微环境，肿瘤细胞与宿主细胞间相互作用均是决定肿瘤转移的重要因素等[8]。部分学者认为肿瘤转移靶组织活化先于癌细胞转移，靶组织的微环境变化对肿瘤向该组织转移提供了有利条件[9-11]。在肿瘤微环境中主要包含了多种非恶性的支持基质细胞，其在肿瘤细胞诱导下在其周围产生大量的生长因子、黏附分子、趋化因子以及基质降解酶以促进血管生成和基底膜破坏，使肿瘤的侵袭能力增强[12]。MMP-2是人体内降解细胞外基质的主要酶类，相关研究[13-15]表明MMP-2高表达的患者相对于MMP-2低表达患者总的生存率明显缩短。MMP-12过表达结肠癌患者其肿瘤浸润深度、淋巴管及血管浸润程度均好于MMP-12阴性表达者，在抗肿瘤和抗血管生成方面有重要作用[16-17]。ERK1/ERK2主要功能是将细胞外各种环境因素变化的信息传递至胞内，抑制ERK/MAPK信号通路的转导在体外能使肿瘤细胞恢复到非转化的状态，在体内则能抑制肿瘤的生长[18-19]。

本研究发现，寒凝血瘀状态对小鼠自发性结肠癌肺转移模型中MMP-2、ERK1/2的表达具有一定的促进作用，采用温阳活血化瘀中药干预后可下调MMP-2、ERK1/2的表达；对于寒凝血瘀状态荷瘤小鼠采用温阳活血化瘀中药干预后可一定程度上促进MMP-12的表达。由此得出，寒凝血瘀状态可以促进肿瘤转移发生，采用温阳活血法干预寒凝血瘀状态可改善肿瘤靶组织转移的微环境，从而降低肿瘤转移率。

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（收稿：2016-02-08 修回：2016-04-30）

Effects of Yang-warming and Blood-activating Therapy on MMPs and ERK in Mice with Colorectal Tu-morwith Chinese Differentiation Syndrome of Cold Coagulation and BloodStasis

TANG Penglin1,GUO Yong21 Department of Internal Medicine,the Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310005),China；2 Department of Internal Medicine,the First AffiliatedHospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of Chinese medicine cold coagulation and blood stasis syndrome and Yang-warming and blood-activating therapy on tumor metastasis.MethodsForty-eight Balb/c mice were randomly divided into 6 groups：blank control group,tumor-bearing group,tumor-bearing+cold coagulation and blood stasis syndrome group（control group with tumor bearing）,tumor-bearing+cold coagulation and blood stasis syndrome+herb medicine group（treatment group）,with 12 mice in each group.Except for blank control group,cold coagulation and blood stasis syndrome model was established in other groups.The expression of MMPs and ERK in lung tissue was determined by western blot assay.ResultsCompared with tumor-bearinggroup,ERK1/2 and MMP-2 of control group with tumorbearing were higher（ERK1/2 RI value：1.40±0.01 vs 0.98±0.03;MMP-2 RI value：1.26±0.05 vs1.00±0.04;all P＜0.05）.Compared with control group with tumorbearing,treatment group had decreased ERK1/2（RI value：1.18±0.01 vs 1.40±0.01,P＜0.01）and MMP-2（RI value：1.01±0.05 vs 1.26±0.05;all P＜0.01）, but increased MMP-12 level（RI value：1.23±0.03 vs 1.08±0.06，P＜0.05）.ConclusionYang-warming and bloodactivating therapy can decrease the expression of ERK1/2 and MMP-2 and increase MMP-12 of lung tissuein tumor-bearing mice to influence tumor stroma and the formation of tumor vessels and consequently reduce the incidence of tumor metastasis.

mice;CT-26 cancer cells;cold coagulation and blood stasis;Yang-warming and blood-activating therapy;MMP-2;MMP-12;ERK1/2

浙江省中医药科技计划项目（No.2012ZA049）

1浙江中医药大学附属第三医院肿瘤内科（杭州 310005）；2浙江中医药大学附属第一医院肿瘤内科（杭州 310006）

郭勇，Tel：13588887292；E-mail：guoyong1047@163.com