草莓炭疽病菌鉴定技术规程

张丽勍 段 可 袁联国 姚全林 姚丽英 倪秀红 高清华*

（1上海市农业科学院林木果树研究所，上海市设施园艺重点实验室 201403；2上海市奉贤区农业技术推广中心 201400；3上海金瓶蔬果专业合作社，青浦区 201711；4上海市金山区农业技术推广中心 201500；5上海市浦东新区农业技术推广中心 201201）

草莓炭疽病菌鉴定技术规程

张丽勍1段 可1袁联国2姚全林3姚丽英4倪秀红5高清华1*

（1上海市农业科学院林木果树研究所，上海市设施园艺重点实验室 201403；2上海市奉贤区农业技术推广中心 201400；3上海金瓶蔬果专业合作社，青浦区 201711；4上海市金山区农业技术推广中心 201500；5上海市浦东新区农业技术推广中心 201201）

草莓是上海地区重要的经济作物，但草莓炭疽病严重阻碍了当地草莓产业的持续稳定发展。现根据草莓炭疽病菌的生物学特性，结合序列分析，依据国家和行业的有关安全生态标准，对草莓炭疽病病害的症状、鉴定技术作了规定，制定了草莓炭疽病菌鉴定技术规程，以供参考。

草莓；炭疽病菌；鉴定；技术规程

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)属蔷薇科草莓属，多年生草本植物。作为目前上海地区园艺作物中的特色优势产业，种植草莓的经济效益十分显著，上海市郊草莓种植面积常年维持在2 666.67 hm2左右，产值超过6亿元。

在我国，草莓炭疽病危害严重的年份会导致减产50%-80%，甚至绝产。因此，草莓炭疽病已成为草莓产业持续稳定发展的瓶颈。同时，种植户对草莓炭疽病菌的生活史及危害特点缺乏科学辨识，在其防治中存在许多误区，滥用和乱用化学农药，导致果品中农药残留超标，不仅影响了草莓果品的质量，也加剧了对生态环境的破坏。为解决食品安全和环境保护问题，促进上海市草莓产业健康发展，笔者根据草莓炭疽病菌的生物学特性，结合序列分析，依据国家和行业的有关安全生态标准，对草莓炭疽病病害的症状、鉴定技术作了规定，制定了草莓炭疽病菌鉴定技术规范，该规范适用于上海地区草莓炭疽病菌的鉴定。

1 草莓炭疸病菌的检测鉴定

草莓炭疽病是由半知菌类黑盘孢目黑盘孢科刺盘孢菌属（Colletotrichum spp.）真菌引起的病害，主要包括3种病原菌：草莓炭疽菌（Colletotrichum fragariae）、尖孢炭疽菌（C. acutatum）和胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。束状炭疽菌（C. dematium）偶尔也会引起果腐，但在草莓上较为少见。危害症状、菌落的形态特征、致病力是检测鉴定该病菌的依据。

1.1 取 样

草莓炭疽病菌能侵染草莓的多个部位，各部位的症状特点如下：（1）叶柄和匍匐茎上的病斑。在匍匐茎和叶柄上的病斑起初小，有红色条纹，之后迅速扩展为深色、凹陷和硬的病斑。叶柄上的病斑逐渐扩大，环绕叶柄后可引起叶片萎蔫死亡。叶柄上的病斑也可扩展到根颈，导致根颈腐烂。（2）根颈腐烂。最初症状是病株在水分胁迫期间（如夏季）的午后表现萎蔫。将萎蔫植株的根颈部纵切开，可见红褐色、硬的腐烂，或红褐色的条纹。根颈病斑通常在近叶柄基部的一侧开始产生，然后以水平的“V”字形扩展至根茎。（3）芽腐。在植株移栽到产果田的几天内或在定植和形成多个根茎后的几周内，尖孢炭疽菌会引起植株的芽腐。有多个根茎的植株，只在一个芽上腐烂，然后这个芽死亡，而其余根茎继续生长，或腐烂发展后引起整株萎蔫和死亡。（4）果腐。在将要成熟的果实上，形成淡褐色、水渍状的斑点，并迅速发展为硬的圆形病斑，病斑通常变成暗褐色至黑色，但也有的保持棕褐色。（5）花枯。被侵染的花朵迅速死亡、干枯，产生黑色病斑，延伸至花梗下面距花萼几毫米处。开花期间如果温暖潮湿，整个花序都可能死亡，植株呈枯萎状。（6）叶斑。草莓叶部有两种炭疽病：一种是炭疽叶斑病，也叫黑斑病，由草莓炭疽菌和胶孢炭疽菌引起；另一种是不规则叶斑病，由尖孢炭疽菌引起。炭疽叶斑病的病斑呈圆形，直径0. 5-1.5 mm不等，偶尔有3mm的病斑，通常呈黑色，有时为浅色，常类似于墨水渍。不规则叶斑病的病斑呈深褐色，近于黑色，叶尖及叶缘干枯，病斑通常在近叶尖处的边缘开始形成，沿叶缘扩展为3-18 mm，沿中脉。病原菌的不同小种，会导致不完全相同的症状。按照草莓炭疽病在田间的典型表征进行取样。受侵染植株各部位的症状（见图1）。

1.2 病菌分离

图1 草莓炭疽病危害症状

从病健交界处切取小块组织：叶片剪成5 mm×5 mm左右的小块，叶柄和匍匐茎切成长0.5 cm左右的小段，根部剖开后取开始褐变的组织切成0.5 cm的小段作分离材料。

分离技术：材料先用75%酒精漂洗10s，紧接着用3%-5%次氯酸钠水溶液消毒2-5 min（叶片消毒1-2 min，叶柄和匍匐茎的灭菌时间稍长），再用无菌水漂洗3-4次，每次l min，然后置于PDA（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g）培养基上、25 ℃下培养，待菌落长出后结合显微观察形态进行单孢分离。

1.3 病菌鉴定（分子生物学方法）

鉴定方法：纯化菌株经25 ℃培养5-7 d后，制备模板DNA，扩增ITS序列（见表1），用无菌双蒸水代替模板做空白对照，扩增目的片段大小约为600 bp。PCR产物回收后测序，测序结果与GenBank数据库中的已知菌株序列进行BLAST比对。若与已知的炭疽病菌序列一致性达90%以上，则判定检测结果为阳性；反之若与已知的炭疽病菌序列不一致，则判定检测结果为阴性。观察发病情况，再对发病植株进行病菌分离培养和鉴定。

表1 ITS序列引物

2 草莓炭疽病菌的鉴定标准

2.1 炭疽病菌营养体及繁殖器官的形态确定和显微观察

2.1.1 胶孢炭疽菌

在PDA培养基上，菌落呈灰白色、橄榄色、黑灰色至黑色，在同心轮纹上通常可见橙色的分生孢子团，气生菌丝均匀，毡状或絮状。背面不均匀灰色，或随菌龄变黑。在培养基上不产生任何红色素，有的有刚毛，大部分有子囊壳形成，在粉红色的孢子堆中有分生孢子形成。分生孢子呈椭圆形，两端钝圆。单孢大小为14.5-18.6 (16.6) × 5.4-7.0 (6.2) μm（见图2E）。

图 2 草莓炭疽病病菌的形态特征

DNA提取方法：将0.5 g研磨好的菌丝样品加入10 mL尿素提取液(7 mol/L Urea、50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、62.5 mmol/L NaCl、1%SDS)，摇匀；在12 000 r/ min条件下离心5 min，吸取上清液，上清液在12 000 r/ min条件下再次离心5 min；将上清液移入另一新管中，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1)溶液，用力振荡数次混匀，在12 000 r/min条件下离心5 min；取上清到一新管中，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3 mol/L NaAc (pH 5.2)，于-20 ℃放置20 min，在12 000 r/min条件下离心5 min；弃上清液，倒置使管壁液体流尽，用70%无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥 5-10 min，溶于 200μL双蒸水中，加入 RNase A (10μg/μL) 2μL，37 ℃水浴30 min，于-20 ℃保存备用。

PCR反应体系：无菌双蒸水16.7μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 1μL，Mg2+(25 mmol/L) 1.5μL，引物ITS1（10 pmol/L）1μL，ITS4（10 pmol/L）1μL，DNA模板（50 mg/L）1μL，rTaq（5 U/μl）0.3μL。1.4 病原菌致病力测定

将分离、纯化得到的病原菌菌株置于酵母蛋白胨葡萄糖培养液（酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g）中，于25 ℃、黑暗条件下振荡培养2-3 d，产生大量小型分生孢子。离心去除培养液并用无菌水冲洗，然后配制成浓度约为1×106个/mL的孢子悬浮液。

供试草莓品种为“久香”（上海市农科院2007年育成品种），采用喷雾法，将孢子悬浮液喷洒至植株上，采用保湿膜保湿24 h。每个菌株接种健壮草莓苗50株。接种7-15 d后

2.1.2 草莓炭疽菌

在PDA培养基上，菌落呈白色至灰白色，无子囊壳形成。分生孢子为倒卵形或一端略尖，无色、单孢。单孢大小为14.1-20.0 (16.9) ×5.3-6.5 (5.9) μm（见图2C）。

2.1.3 尖孢炭疽菌

在PDA培养基上，菌落初期呈白色至乳白色或浅粉红色，后随着培养时间的增加，变为灰色和黑灰色。菌落背面初期为粉色或畦肉色，后期变为黑色。未发现有刚毛和有性态的产生。25℃下培养，尖孢炭疽菌生长速度很慢，而胶孢炭疽菌和草莓炭疽菌的生长则快得多。分生孢子直，梭形，两端尖，有时中部轻微缢缩。单孢大小为13.2-5.1(15.1)× 4.8-6.3 (5.5) μm（见图2D）。

2.2 致病性测定

若测定结果可导致“久香”草莓叶片形成局部病斑，茎上形成黑色、纺锤形或椭圆形、溃疡状病斑，稍凹陷，甚至全株萎蔫枯死，且从发病植株上进行病菌再分离培养，可得到与原接种菌相同培养性状和形态特征的病原菌，则可判定该病菌为草莓炭疽病菌。

3 结果判定

如果症状和分离物的各形态特征与描述的症状和病原菌形态相吻合，且序列比对一致，则可判定为草莓炭疽病菌。

2015-07-18

*为通讯作者。