不同产地玛咖中总生物碱的含量测定研究

范 祥，蔺 苗，杨永寿，田昆仑，王光明

（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；3.大理大学临床医学院，云南大理 671000）

不同产地玛咖中总生物碱的含量测定研究

范 祥1，蔺 苗2，杨永寿2，田昆仑1，王光明3*

（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理 671000；3.大理大学临床医学院，云南大理 671000）

目的：采用酸性染料比色法对不同产地玛咖样品中总生物碱的含量进行测定，以评价其品质。方法：以氧化苦参碱为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定玛咖中总生物碱的含量，并对玛咖总生物碱的提取方法、显色剂的用量、pH值、检测波长进行考察。结果：采用超声提取，时间为40 min，提取3次，显色剂用量为6 mL，pH为7.2，测量波长为415 nm，玛咖中总生物碱含量相对较高的3个产地是秘鲁、丽江和迪庆。结论：本法操作简便，灵敏度高，重现性好，可作为玛咖中总生物碱的含量测定方法。

玛咖；总生物碱；紫外-可见分光光度法；含量测定

玛咖（Lepidium meyennii Walp）为十字花科（Brassicaceae）独行菜属（Lepidium）1年生草本植物，药用部位为地下球茎，颜色有紫色、黄色、白色3种。玛咖原产于秘鲁海拔3500m以上的安第斯山区，已有几千年的栽培历史，是当地不可缺少的作物之一〔1〕，在我国，玛咖主要作为保健品。研究表明，玛咖富含植物蛋白、氨基酸、脂肪及微量元素等营养成分，还含有多种次生代谢物质：玛咖烯（macaene）、生物碱（包括玛咖酰胺macamide）、芥子油苷及其水解衍生物、甾醇、多酚类及其他成分〔2-4〕。其中玛咖生物碱可提高动物成熟卵泡小体的数量、精子的流动性和精子的数量，从而可显著提高哺乳动物和鱼类的生育力〔2-5〕。玛咖生物碱还可以作用于视丘下部和脑垂体，具有调节内分泌腺（如肾上腺、甲状腺、胰腺、卵巢等）的功能，能够起到平衡荷尔蒙的作用，因此可用于治疗女性更年期综合征〔5〕。其营养成分还具有增强人体精力、耐力等功效，因此又常被称为”秘鲁人参”。

近年来，由于国内保健品市场对玛咖的需求量大增，玛咖被我国多地引种栽培〔6〕，但生长环境不同，是否对玛咖中主要成分造成影响，未见相关文献报道。本文采用酸性染料比色法对不同产地9批玛咖中总生物碱的含量进行测定，以考察不同产地玛咖的品质。

1 材料

1.1仪器超声波清洗器（SB2200，宁波新芝生物科技股份有限公司）；恒温水浴锅（SSY-4，北京泰克仪器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；酸度计（pHS-25，上海虹仪仪器厂）；电子天平（AE240，瑞士梅特勒）；双光束紫外-可见分光光度计（UV2500，日本岛津）。

1.2试药9批不同产地玛咖样品（产地分别为秘鲁、曲靖会泽、丽江玉龙雪山、迪庆香格里拉、东川因民、昆明禄劝、新疆塔什库尔干、大理宾川、四川阿坝，由大理大学生药教研室杨月娥老师鉴定为十字花科独行菜属草本植物玛咖）；氧化苦参碱（中国生物制品药品研究院，批号：110780-201007），其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1溶液的配制

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取经粉碎后过2号筛的玛咖粉0.5 g于150 mL圆底烧瓶中，加入20 mL甲醇，超声提取40 min，残渣重复提取2次，合并提取液，减压浓缩至干后加20 mL 2%的HCl溶液溶解浸膏，洗涤烧瓶，合并酸液。用10%氢氧化钠溶液调pH至7.2，再用等体积氯仿萃取3次。合并萃取液，减压浓缩回收氯仿，用甲醇分次溶解、洗涤，合并甲醇液，定容至10 mL，即得玛咖总生物碱的供试品溶液〔7-9〕。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取氧化苦参碱对照品0.1 g，用甲醇溶解，定容至100 mL，即得浓度为1.0 mg∕mL的对照品溶液。

2.1.3 溴麝香草酚蓝显色剂的配制 精密称取溴麝香草酚蓝0.125 g，溶于1 000 mL的磷酸缓冲溶液中（0.2 mol∕L Na2HPO4与0.2 mol∕L NaH2PO4溶液等量混合），混匀即得〔10-12〕。

2.2测量波长的选择分别精密量取“2.1.1”项的玛咖总生物碱提取液1.0 mL和“2.1.2”项下得到的对照品溶液1.0 mL于10 mL量瓶中，分别加入溴麝香草酚蓝6.0 mL，用甲醇定容，摇匀，静置显色15 min，即得样品和对照品待测液，同法配制空白对照液。以空白对照液校正仪器，在400～700 nm范围内分别扫描对照品测定液和样品测定液。

2.3单因素考察

2.3.1 pH值考察 精密量取“2.1.1”项下制备好的玛咖样品溶液6份，每份1.0 mL，分别加入pH值为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6的溴麝香草酚蓝显色剂6.0 mL，用甲醇定容，震荡摇匀，静置显色15 min，在415 nm处测定吸光度。

2.3.2 显色剂用量考察 精密量取“2.1.1”项下制备好的玛咖样品溶6份，每份1.0 mL于10 mL量瓶中，分别加入pH为7.2的溴麝香草酚蓝显色剂2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，用甲醇定容，震荡摇匀，静置显色15 min，在415 nm处测定吸光度〔13-15〕。

2.3.3 提取方法的考察 精密称取经粉碎过2号筛的玛咖粉末0.5 g，共称取6份。置150 mL圆底烧瓶中，加20 mL甲醇，分别进行超声和回流提取，提取时间为40 min。按“2.1.1”项方法操作得样品提取液，分别加入溴麝香草酚蓝显色剂6.0 mL，用甲醇定容，震荡摇匀，静置显色15 min，于415 nm波长处扫描，测定〔11-13〕。

2.4样品含量测定分别精密称取来自不同产地的9批玛咖样品粉末各3份，每份0.5 g，按“2.1.1”项下制备待测样品溶液。各精密量取1.0 mL，按“2.2”项下方法显色，测其吸光度，计算样品中总生物碱的含量。

3 结果

3.1提取方法按“2.3.3”项试验方法确定提取方法。见表1。结果表明，超声提取法的玛咖中总生物碱的平均含量为4.71 mg∕g，回流提取的玛咖中总生物碱的平均含量为3.05 mg∕g。因此选择超声提取法作为玛咖中总生物碱的提取方法。

表1 提取方式比较（n=3）

3.2测量波长的选择按“2.2”项试验方法对样品和对照品溶液进行显色测定。见图1。结果表明，对照品和样品在415 nm处均有最大吸收，故选择415 nm为本实验测量波长。

3.3 pH值的选择按“2.3.1”项试验方法确定实验过程中缓冲液pH值。见图2。缓冲液pH值对玛咖中总生物碱提取液吸光度的影响如图2所示，当磷酸盐缓冲液的pH为7.2时所测得的吸光度值最大，表明此时显色剂解离成的阴离子与玛咖生物碱阳离子定量结合形成稳定的有色离子对最多，故选择缓冲溶液pH7.2。

3.4显色剂用量考察按“2.3.2”项试验方法确定显色剂的用量。见图3。结果表明，显色剂的最佳用量为6.0 mL。

图2 pH考察

图3 显色剂用量考察

3.5样品含量测定按“2.4”项测定不同产地玛咖中总生物碱的含量。见表2。结果表明，秘鲁产的玛咖中生物碱的含量最高，丽江、迪庆两个地区次之，东川、禄劝、宾川产的玛咖生物碱含量较低。

表2 样品测定（n=3）

3.6方法学考察

3.6.1 线性关系考察 精密移取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL量瓶中，加麝香草酚蓝显色剂6.0 mL，用甲醇定容，震荡摇匀，静置显色15 min，于415 nm处测定吸光度，以氧化苦参碱对照品的浓度（C）为横坐标，对应的吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程A= 12.874C-0.034 1（r=0.999 2），结果表明，氧化苦参碱在0.01～0.12 mg∕mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

3.6.2 精密度试验 精密移取苦参碱对照品溶液1.0 mL，按“2.2”项下方法操作，显色后于415 nm处重复测定吸光度5次，测定结果的RSD为0.8%（n= 5），表明仪器的精密度良好。

3.6.3 稳定性试验 精密量取“2.1.1”项下制得的玛咖总生物碱提取液1.0 mL按“2.2”项下方法显色，在415 nm处每隔20 min测1次其吸光度值，测得结果的RSD为0.58%（n=6），结果表明样品液在2 h内稳定。

3.6.4 重复性试验 精密称取同一批经粉碎后过2号筛的玛咖粉末5份，每份0.5 g，按“2.1.1”项下制备样品溶液，精密量取1.0 mL，按“2.2”项下方法显色，测定，计算得玛咖中总生物碱的平均含量为4.11 mg∕g，RSD为0.7%（n=5），表明方法的重复性好。

3.6.5 回收率试验 精密称取已知总生物碱含量（4.11 mg∕g）的玛咖样品粉末9份，精密加入各加标量对应的苦参碱对照品，按“2.1.1”项制备样品溶液。精密量取各待测样品溶液1.0 mL，按“2.2”项试验方法显色，测定吸光度，计算回收率。见表3。

表3 回收率试验结果（n=9）

4 讨论

试验对9个不同产地，不同颜色的玛咖中总生物碱的含量进行测定，结果表明种植在海拔为3 300～3 600 m，昼夜温差20℃以上、水资源丰富的秘鲁、丽江、迪庆这3个地区产的玛咖中总生物碱的含量相对较高，品质最好。种植在海拔在3 100 m左右，昼夜温差为15℃左右、水资源相对丰富的四川阿坝、新疆塔什库尔干两个地区的玛咖中总生物碱含量低于秘鲁等地区，其品质一般。而种植在平均海拔为2 400 m左右，昼夜温差10℃左右，水资源相对匮乏的曲靖会泽、东川因民、昆明禄劝、大理宾川4个地区的玛咖中总生物碱的含量最低，品质较差。该结果表明海拔和昼夜温差的改变，土壤水分含量差异会对玛咖中有效成分的积累有较大影响。

研究结果表明，玛咖中生物碱的含量与颜色无关，而与生长环境关系紧密，该结果与文献报道〔9〕不一致，有待进一步增大样本量进行研究。

在本试验中，用2%的盐酸洗涤浸膏3次〔14-16〕，使生物碱以生物碱盐的形式存在于水中，其目的是去除酸性滤液中的脂肪酸、色素及鞣质类等杂质；再用10%NaOH调节pH值至10，在碱性条件下，生物碱盐与碱作用转化成游离的生物碱，它们较易溶于有机溶剂。由文献资料可知，玛咖中的生物碱主要为非水溶性生物碱〔7〕，因此可用有机溶剂氯仿对其萃取。

由于玛咖总生物碱中成分较多，而各组分的研究相对缺乏，目前玛咖中已知的几种重要生物碱的含量都很低，无法得到其标准品，因此选择结构相似的氧化苦参碱作为对照品，扫描结果表明，氧化苦参碱与玛咖生物碱的紫外-可见吸收光谱一致，在415 nm处均有最大吸收峰，因此可选择氧化苦参碱做为对照品。

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Research on Determination of Total Alkaloids in Different Areas Maca

Fan Xiang1,Lin Miao2,Yang Yongshou2,Tian Kunlun1,Wang Guangming3*
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali, Yunnan 671000,China;3.Clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:TodeterminatethecontentoftotalalkaloidsinMacafromdifferentoriginswithaciddyecolorimetryforevaluating thequality.Methods:Takingtheoxymatrineasreferencesubstance,UV-visiblespectrophotometrywasusedtodeterminatethecontentof total alkaloid Maca,and extraction method,the amount of coloring agent,pH value,determine wavelength were observed as well.Results: Ultrasonic extraction was used to extract for three times with 40 minutes each time and the amount of reagent was 6 mL,pH was 7.2,and measurement wavelengthλwas 415 nm.Maca produced in Peru,Lijiang and Diqing enjoy higher content of total alkaloids.Conclusion: Thismethodissimple,sensitive,andreproducible,whichcanbethemethodofdeterminingthecontentoftotalalkaloidsinMaca.

Maca;total alkaloids;UV-visible spectrophotometry;determination

R284

A

2096-2266（2016）12-0043-04

10.3969∕j.issn.2096-2266.2016.12.010

（责任编辑 李 杨）

2015-08-31

2015-10-09

范祥，硕士研究生，主要从事病理学研究. *通信作者：王光明，教授，博士.