响应面法优化黄连饮片中盐酸小檗碱提取工艺

陈凯，李慧，王佳奇，王月亮，宋明铭，丁传波，李莹，刘文丛*，郑毅男, 徐晓华

(1.吉林农业大学中药材学院化学教研室，长春 130118；2.中国中医科学院中药研究所制剂中心，北京 100000； 3.吉林大学中日联医院， 长春 130031)

响应面法优化黄连饮片中盐酸小檗碱提取工艺

陈凯1,2，李慧2，王佳奇1，王月亮1,2，宋明铭1，丁传波1，李莹1，刘文丛1*，郑毅男1, 徐晓华3*

(1.吉林农业大学中药材学院化学教研室，长春 130118；2.中国中医科学院中药研究所制剂中心，北京 100000； 3.吉林大学中日联医院， 长春 130031)

运用Box-Behnken响应曲面法设计料液比、提取次数、H2SO4浓度及提取时间4因素3水平的试验模型，以盐酸小檗碱的得率为评价指标，对黄连饮片中盐酸小檗碱的提取工艺进行优化。优选出最佳提取工艺参数为：H2SO4浓度为3%，料液比为1∶10，提取3次，每次2 h。测定盐酸小檗碱的得率为8.36%，与预测值8.30%基本相符合，偏差较小。该工艺稳定，可靠，为黄连饮片中盐酸小檗碱的研究提供了依据。

黄连饮片；盐酸小檗碱；响应面法

黄连为毛莨科植物黄连(CoptischinensisFranch.)、三角叶黄连(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsial ) 或云连 (CoptisteetaWall.) 的干燥根茎，主要含盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀等原小檗碱型生物碱。其中盐酸小檗碱为主要活性成分，含量高达11.3%[1-3]，对多种革兰阳性及阴性菌均具有抑制作用，其中，对溶血性链球菌，金黄色葡萄球菌，霍乱孤菌、痢疾杆菌有较强的抑制作用，低浓度时抑菌，高浓度时杀菌。多项体外实验结果证明小檗碱能够增强白细菌性痢疾等肠道感染，效果显著。盐酸小檗碱是临床上一种常用的广谱抗菌药，主要用于猪、马、牛、羊菌痢、胃肠炎、痈肿等细菌性感染[4-5]，广泛用于多种制剂。

黄连中盐酸小檗碱的含量直接影响其在临床上的疗效，而提取方法是影响其得率的最主要因素。传统提取小檗碱方法主要有酸法、碱法、醇法3类。目前，将响应面法应用于优化黄连中盐酸小檗碱酸水提取法的报道相对较少，本文选择酸水法提取，依据单因素提取实验结果，选取对提取有影响的酸水浓度、提取时间、提取次数及料液比四个因素，以小檗碱含量为指标，采用中心组合设计-响应面法确定最佳酸水提取工艺，并且具有试验次数少、精度高的优点，以期为提高黄连的利用率提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 黄连饮片，购于河北安国市昌达中药材饮片有限公司，自然风干，粉碎，过60目筛。

1.1.2 盐酸小檗碱对照品 批号：110713-201212，纯度98%，购于中国食品药品检定研究院。

1.1.3 仪器与试剂 LC20AT型高效液相色谱仪(日本岛津)；酒精计(河北省沧县杜生热工仪表厂)；乙腈(色谱纯，Fisher 公司)；甲醇(色谱纯，Fisher公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Welch C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(50：50)(每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0)，流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为345 nm。

1.2.2 标准曲线的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品5 mg，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，分别移取2、4、6、8 mL对照品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的对照品溶液。按照 1.2.1项分析条件检测，进样量10 μL，以峰面积对质量浓度进行线性回归,计算标准曲线回归方程。

1.2.3 盐酸小檗碱的提取及测定 称取黄连粉末3.00 g至50 mL圆底烧瓶内，称重，以一定的料液比加入不同浓度的H2SO4溶液进行回流提取后，放冷至室温，提取数次后，合并提取液，滤过，取10 μL滤液，按照1.2.1项下的色谱条件进行测定。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 最佳H2SO4浓度的筛选 根据文献，提取盐酸小檗碱H2SO4浓度的范围为2%～5%，选择了1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%的稀硫酸作为考察的浓度，料液比为1∶8(g/mL)，热回流提取1 h，滤过，放冷，得供试品溶液，测定，计算盐酸小檗碱得率。

1.2.4.2 最佳料液比的筛选 选择H2SO4浓度为3%，料液比分别为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14(g/mL)，热回流提取1 h，滤过，放冷，得供试品溶液，测定，计算盐酸小檗碱得率。

1.2.4.3 最佳提取时间的筛选 选择H2SO4浓度为3%，料液比为1∶10(g/mL)，分别热回流提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，滤过，放冷，得供试品溶液，测定，计算盐酸小檗碱得率。

1.2.4.4 最佳提取次数的筛选 选择H2SO4浓度为3%，料液比为1∶10(g/mL)，分别热回流提取1、2、3、4、5次(每次提取后将药液滤除后，按照料液比重新添加溶剂)，每次2 h，滤过，放冷，得供试品溶液，测定，计算盐酸小檗碱得率。

1.2.5 响应曲面分析试验 综合单因素试验结果，应用响应曲面分析法对提取工艺进行优化。选取4个因素：硫酸浓度，料液比，提取时间及提取次数，通过Design Expert 8.0.6 软件，根据Box-Behnken 试验设计原理，对提取工艺进行响应面分析。分析因素和水平设计如表1所示。

表1 响应面分析试验因素与水平表

2 结果与分析

2.1 线性关系考察 测定不同浓度的盐酸小檗碱对照品溶液在345 nm下的峰面积，以质量浓度X(mg/mL)对峰面积Y绘制标准曲线，得到回归方程为Y=3.7076X-3.9048，R2=0.99996，在0.6954～1.9845 μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 单因素试验

2.2.1 H2SO4浓度对盐酸小檗碱得率的影响 由图1可知，随着H2SO4浓度的升高，盐酸小檗碱的得率也随之增加，当H2SO4浓度为3%时，小檗碱的得率达到最高，之后又随着H2SO4浓度的增加而降低。因此，Box-Behnken 试验选取的H2SO4浓度的范围为2.5%～3.5%。

图1 H2SO4浓度对盐酸小檗碱得率的影响

2.2.2 料液比对盐酸小檗碱得率的影响 由图2可知，随着料液比的增加，盐酸小檗碱的得率也随之增加，当料液比为1∶10时，小檗碱的得率达到最高，之后又随着料液比的增加而降低。因此，Box-Behnken 试验选取的料液比的范围为1∶8～1∶12。

2.2.3 提取时间对盐酸小檗碱得率的影响 由图3可知，随着提取时间的增加，盐酸小檗碱的得率也随之增加，当提取时间为2 h时，盐酸小檗碱的得率达到最高，之后又随着提取时间的增加而降低。原因可能为盐酸小檗碱具有热不稳定性，随着提取时间的不断增加，盐酸小檗碱达到峰值，持续加热，使其分解[6-7]，继而含量降低。因此，Box-Behnken 试验选取的提取时间的范围为1～2 h。

图2 料液比对盐酸小檗碱得率的影响

图3 提取时间对盐酸小檗碱得率的影响

2.2.4 提取次数对盐酸小檗碱得率的影响 由图4可知，随着提取次数的增加，盐酸小檗碱的得率也随之增加。综合考虑小檗碱的得率、成本、能源节约等因素[8-10]，Box-Behnken 试验选取的提取次数的范围为1～3次。

图4 提取次数对盐酸小檗碱得率的影响

2.3 响应面优化试验分析

2.3.1 响应面试验优化结果 由单因素试验分析，根据Box-Behnken 中心组合实验原理设计了4因素3水平的响应面分析方法进行优化试验。1～24 为析因实验，25～29 为中心试验，分析方案及实验结果见表2。X1表示H2SO4浓度，X2表示料液比，X3表示提取时间，X4表示提取次数。

2.3.2 建立模型方程与显著性检验 利用Design-Exper8.0.6 软件对试验数据进行多元化回归拟合分析，得到盐酸小檗碱得率与各因素变量的二次方程模型为：

Y= 8.30+ 0.35X1+ 0.15X2- 0.04X3+

0.1075X4+0.06X1X2+0.07X1X3+

0.043X1X4+0.029X2X3-0.35X2X4-

表2 Box-Behnken 的中心组合方案及响应值

表3 回归方程方差分析表

续表

注：*表示有显著影响(P<0.05)；**表示有极显著影响(P<0.01)

根据方差分析，响应面方程极显著地表示了Y与X1，X2，X3及X4的关系，响应面方程计算的理论值与实际值的比较见表4。

表4 理论值和实际值的比较

2.3.3 响应曲面分析 各两因素交互作用对盐酸小檗碱得率影响的响应曲面见图5。A图为等高线，B图为其相对应的响应曲面图。

图5 各两因素交互作用对盐酸小檗碱影响

2.4 盐酸小檗碱提取条件验证试验 当H2SO4浓度为3%，料液比1∶10，提取时间为2 h，提取次数为3次时，测定盐酸小檗碱的得率为8.36%，与预测值8.30%基本相符合，偏差较小。说明得到的回归方程与实际情况拟合较好，进一步验证了该模型的可行性。

3 讨论与小结

在单因素试验的基础上，通过响应曲面分析对黄连中盐酸小檗碱的提取工艺进行优化，并得到回归方程。结果表明，各影响因素对盐酸小檗碱的影响程度大小依次为H2SO4浓度>料液比>提取时间>提取次数。料液比和提取次数对盐酸小檗碱得率的交互影响最为显著。经回归分析并结合实际条件确定黄连中盐酸小檗碱最佳提取工艺为H2SO4浓度为3%，料液比1∶10，提取时间为2 h，提取3次，测定实际盐酸小檗碱得率为8.36%，与预测值8.30%相符。据文献报道，肖美凤等[13]用正交实验法对黄连中小檗碱提取工艺进行优选，小檗碱的得率为6.72%；孙波等[14]就水提法部分进行正交优选， 确定水提法用水煎煮3次，3.5 h，加水量14倍为最佳工艺，小檗碱得率为5.28%；吕霞等[15]报道用0.5%硫酸水溶液提取黄连中小檗碱，分别采用索氏提取、超声提取和浸渍提取，HPLC法分析小檗碱浓度分别为16.401、14.246、 13.415 μg/mL。与浸渍提取方法相比，本研究相对省时，较超声方法提取的更加完全，且本研究盐酸小檗碱的得率相对较高。实验结果说明该回归方程可以较好预测实验结果。因此，选择响应曲面法来优化黄连中盐酸小檗碱的提取工艺是可行的。

盐酸小檗碱遇高温易被破坏[16-17]，并且受热时间延长，可致黄连中其他生物碱分解[18-20], 因此，在处理样品全过程中应尽量避免高温。低温时，生物碱较稳定[21-23]，室温贮藏一段时间后总生物碱含量基本保持不变。

[1] 赵庆国，吴素体，王颖，等.不同品种和产地黄连的总生物碱含量测定[J].时珍国医国药，2001，12(11)：974.

[2] 黄传俊, 李其兰, 高申蓉.正交实验优选黄连提取工艺[J].中国药师, 2005，8(8)：699 -700.

[3] 程永梅，程仁华．小檗碱提取工艺的研究[J] .时珍国医国药，2007，18(6)：1445-1447.

[4] 张涛，张爽，胡格，等．盐酸小檗碱绿原酸和黄芩苷对大肠杆菌的体外抑菌作用[J]．中国兽医杂志，2009，45(1)：42-43.

[5] 李志西,杜双奎.试验优化设计与统计分析[M]. 北京: 科学出版社, 2010:212-243.

[6] 修彦凤，徐得生，冯怡，等. 不同用量的吴茱萸炮制黄连后成分的比较[J].中草药，2003，34(4)：320-322.

[7] Li Q H． Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein [J]．Food chemistry,2005,92(4): 701-706.

[8] 魏安池，代红丽，谷文英. 响应面分析法优化红花黄色素提取工艺条件[J].食品与机械，2006，22(2) ：11-13.

[9] Fukuhara A,Matsuda M,Nishizawa M,etal. Visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin[J]. Science,2005,307(5708):426- 430.

[10]Kong Q X,Xia M,Liang R Q,etal. Increased serum visfatin as a risk factor for atherosclerosis in patients with ischaemic cerebrovascular disease[J]. Singapore Med J,2014，55(7):383- 387.

[11]Gouranton E,Romier B,Marcotorchino,etal. Visfatin is involved in TNFalpha- mediated insulin resistance via an NAD(+) /Sirt1/PTP1B pathway in 3T3- L1 adipocytes[J]. Adipocyte,2014,3(3):180- 189.

[12]Vanhoutte P M. Endothelial dysfunction：the first step toward coronary arteriosclerosis[J]. Circ J,2009,73(4):595- 601.

[13]杨宏建，肖美凤，袁丽，等.正交实验优选三颗针中小檗碱的提取工艺[J].中国药师，2005,8(8)：673-675.

[14]孙波，张永光.正交法优选黄连中盐酸小檗碱的提取工艺[J].海峡药学，1999,11(3)：100-101.

[15]吕霞,张鸿雁，蒋文强，等.HPLC法分析优选黄连提取方法[J].山东医药工业，2003,22(4)：2-4.

[16]贾燕珺，李建军. 小檗碱的抗动脉粥样硬化作用及其机制[J]. 中国动脉硬化杂志，2013，2(4)：364-368.

[17]Cantarini L, Brucato A, Simonini G,etal. Leptin,adiponectin,resistin, visfatin serum levels and idiopathic recurrent pericarditis:biomarkers of disease activity A preliminary report [J]. Clin Exp Rheumatol,2013,31(2):207- 212.

[18]李春英，李晓娟，杨磊，等.响应面分析法优化甘草酸和甘草黄酮联合提取工艺[J] . 黑龙江大学自然科学学报，2009，26(3)：390-395.

[19]Wan Q, Cui X, Shao J,etal. Beijing ambient particle exposure accelerates atherosclerosis in ApoE knockout mice by upregulating visfatin expression[J]. Cell Stress Chaperones，2014,19(5):715- 724.

[20]Zhou F, Pan Y, Huang Z,etal. Visfatin induces cholesterol accumulation in macrophages through up- regulation of scavenger receptor -A and CD36 [J]. Cell Stress Chaperones,2013, 18(5):643- 652.

[21]Goping I S，Gross A，Lavoie J N,etal. Regulated targeting of BAX tomitochondria[J]. J Cell Biol,1998,143(1):207- 215.

[22]Han J，Lee J D，Bibbs L，etal. A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells [J]. Science, 1994, 265(5173):808- 811.

[23]Fisk M，Gajendragadkar P R，Maki- Petaja K M,etal. The rapeutic potential of p38 MAP kinase inhibition in the management of cardiovascular disease [J]. Am J Cardiovasc Drugs, 2014，14(3)：155-165.

(编辑：侯向辉)

Optimization of Extract Process for Berberine Hydrochloride in Coptis chinensis Franch. by Response Surface Methodology

CHEN Kai1,2, LI HUI2,WANG Jia-qi1, WANG Yue-liang1,2,SONG Ming-ming1, DING Chuan-bo1, LI Ying1,LIU WEN-cong1*,ZHENG Yi-nan1, XU Xiao-hua3*

(1JilinAgriculturalUniversityCollegeofTraditionalChineseMedicine，Changchun130118 ,China；2.InstituteofChineseMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100700,China; 3.China-JapanFriendshipHospitalAffiliatedJilinUniversity,Changchun130031,China)

To optimize the conditions for purification of berberine hydrochloride inCoptischinensisFranch, Box-behnkn response surface method was used to design the test modls with four factors including liquid ratio, extraction times, H2SO4concentration and extraction time at three levels based on the single factor experiment, and the pureness of berberine hydrochloride was used as the evaluation index, to optimize purification process of berberine hydrochloride.The optimal purification conditions were determined as extracted three times for 2 h, at a solid-liquid ratio was 1∶10, and the H2SO4concentration was 3%. The determination of berberine hydrochloride at a rate of 8.36%,and the predictive value of 8.30% conforms to the basisi deviation is smaller. The process is stable and reliable,and the results of the study can provide scientific basis for the determination of the purification process of extraction of berberine hydrochloride inCoptischinensisFranch.

CoptischinensisFranch; berberine hydrochloride; response surface methodology

中国中医科学院自主选题(Z02063) ；2009年中医药行业科研专项(200907001-5)

陈凯，在读硕士，从事中药制剂评价与新药研发。

刘文丛。E-mail:jwlw6803@126.com; 徐晓华。E-mail: xuxiaohua681002@qq.com

2016-01-24

A

1002-1280 (2016) 04-0021-08

R931.6