新型蝙蝠流感病毒研究进展

许凯迪，陈鸿军

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·综述·

新型蝙蝠流感病毒研究进展

许凯迪，陈鸿军

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

甲型流感病毒能感染多种宿主。最近，在蝙蝠中鉴定出流感病毒两种新亚型：H17N10和H18N11，扩大了流感病毒宿主范围。与已知毒株不同的是，这两种蝙蝠病毒有着独特的复制特性。进化分析表明，这两种病毒在蝙蝠中长期独立进化，血清学检测阳性率极高。蝙蝠占已分类哺乳动物的20%，暗示有大量未定型的甲型流感病毒存在于这些庞大的隐形宿主中，其潜在流行可能性凸显了这些新病毒的公共卫生学意义。

流感病毒；H17N10；H18N11；公共卫生；蝙蝠

甲型流感病毒（Influenza A virus）亚型众多，在禽、猪和人群中流行和传播的毒株具有重要的公共卫生意义。甲型流感病毒可感染多种动物，包括：灵长类动物、狗、马、猫、牛、海豹、鲸鱼、豚鼠、雪貂、水貂、大熊猫、狸猫、食蚁兽、骆驼和企鹅等[1-3]。最近，在危地马拉小黄肩蝙蝠（叶口蝠科黄肩蝠属）和秘鲁平脸果蝠（叶口蝠科牙买加果蝠属）中发现可能存在H17N10和H18N11两种新型的流感病毒[4,5]。

甲型流感病毒属于正黏病毒科，基因组由8个节段的单股负链RNA组成，通过剪切拼接、移码等机制，至少编码14种病毒蛋白。流感病毒亚型分类依据两种主要的表面蛋白：血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。在鉴定出蝙蝠流感病毒（Bat Influenza virus, BIV）之前，已有16种HA亚型和9种NA亚型流感病毒被发现，主要存在于鸟类、水禽体内。在这些病毒中，只有H1N1、H2N2和H3N2可感染人类并引起大流行[6]。

1 概述

小黄肩蝙蝠的H17N10亚型流感病毒和平脸果蝠的H18N11亚型流感病毒是两种全新的亚型，在进化上与其他流行毒株明显不同[4,5,7]。通过RT-PCR对H17N10三个毒株的全基因组（A/ little yellow-shouldered bat/Guatemala/164/2009、A/ little yellow-shouldered bat/Guatemala/153/2009和A/ little yellow-shouldered bat/Guatemala/060/2010）和H18N11亚型的1株病毒全基因组（A/flat-faced bat/ Peru/033/2010）进行测序发现，这些新亚型基因组结构和可能编码的蛋白与其他甲型流感病毒保持一致。H17N10 BIV最初发现于蝙蝠直肠样本中，在肝脏、肾脏、小肠和肺脏组织中亦存在；而H18N11 BIV的RNA也最先发现于蝙蝠直肠样本中。迄今为止，尚不能从这些动物中分离获得传染性的病毒粒子，但蝙蝠的肠道内存在着大量病毒基因组RNA，说明蝙蝠流感病毒在肠道内具有明显组织嗜性，这一点更倾向于鸟类。而大多数哺乳动物中流感病毒主要感染呼吸道。1979～1982年，研究人员从蝙蝠体内分离了株甲型流感病毒（A/bat/Alma-Ata/73/1976），也发现了在蝙蝠体内有抗流感病毒特异性抗体[8-10]。然而，这株蝙蝠流感病毒与人H3N2病毒的特异性血清产生免疫反应，且蝙蝠血清可识别人类H2N2和H3N2病毒，显然不同于从南美蝙蝠中发现的H17N10和H18N11新亚型病毒。

H17N10和H18N11病毒分离于不同种蝙蝠，间隔时间较久，相距3000多千米。但是这两个亚型却密切相关，并异于其他甲型流感病毒，同时，它们之间差异也相当大[4,5]，这说明这些病毒已存在一段比较长的时间。南美蝙蝠种群的血清阳性率较高，达到50%[5]，说明这两种病毒感染很常见。然而，有研究检测了1300多只欧洲中部的蝙蝠，并未发现任何流感样病毒，说明并不是所有蝙蝠都易被感染[11]。因此，蝙蝠可能是一种迁徙病毒库。

2 公共卫生意义

流感病毒可通过病毒基因突变和整段基因重排机制实现病毒变异，并有效传播给新的宿主，产生适应性复制。进化分析表明，H17N10和H18N11系谱非常古老。NA、内部基因节段（PB2、PB1、PA、NP、NS、M）与来自经典甲型流感病毒对应基因完全不同。H17和H18的HA与H1、H2、H5和H6亚型的HA比较接近。最初猜测是H17和H18的HA有密切联系，特别是与蝙蝠流感病毒其他基因相比，暗示蝙蝠流感与禽流感HA基因发生重排[4]。然而，近年来对禽流感病毒内部基因进行了大量分析，与蝙蝠流感病毒的内源基因似乎并没有太多相关性[7]。H17和H18亚型蝙蝠流感病毒是单独进化而来，并未发生重组。这些病毒在蝙蝠以外传播几率不大，即便发生，也不太可能造成持续性感染。当然，现有认识还很有限，数据量尚小，仍需要进一步监测确定蝙蝠流感病毒的分布规律，确定新的蝙蝠种类中能否分离出BIV，才能全面展示种间流感基因交换是否活跃存在。

跨种传播和人畜共患存在两种主要障碍：病毒入侵和基因组复制转录[12]。入侵主要通过HA调节，基因组复制转录是通过病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase，RDRP）完成。病毒RNA聚合酶是由PB2、PB1、PA组成，与病毒RNA和病毒核蛋白（NP）组成复合物来启动转录、复制[13]。物种特异性的RDRP活性妨碍宿主间转换，来自于禽流感病毒的RDRP在哺乳动物细胞上几乎没有功能[3,14,15]，可能是人类细胞中存在强有力的制约因素有选择性失活禽源聚合酶[16]。PB2亚基的单一突变，即在627位由禽源谷氨酸残基突变为人源赖氨酸残基（E627K），能够突破人类细胞的功能限制[14]。还有一些适应性改变，比如：第二位抑制子突变、PB2核定位序列改变、PA节段发生重排[17]。

蝙蝠病毒聚合酶蛋白和核蛋白（NP）具有保守的活性位点和许多关键的共性功能区。H17N10 BIV PA蛋白的N端结构表明，该区域包含一个核酸内切酶位点，跟其他PA基因一样[18]。令人惊讶的是，蝙蝠流感PB2的第627位既不是赖氨酸也不是谷氨酸，而是其他病毒没有出现过的丝氨酸残基。尽管如此，蝙蝠流感聚合酶在人类和禽类细胞中活性却非常高[4,5]。在禽流感病毒PB2引入蝙蝠流感样S627突变，也能适应人类细胞。蝙蝠细胞能限制禽源病毒聚合酶活性，与禽源聚合酶PB2 E627在人类细胞上情况相同[19]。蝙蝠聚合酶和NP嵌合病毒能在多种哺乳动物高效复制，包括狗、猪、人类和蝙蝠[20]。蝙蝠聚合酶能很好地适应多种蝙蝠，这说明其在跨种传播中并非必需。

那么，人类流感病毒和禽流感病毒能否感染蝙蝠呢？已有报道表明，来自于9种不同蝙蝠的15株细胞都容易感染人类流感病毒[19]。这些细胞来自于果蝠、虫蝠等蝙蝠的多种组织，已构建成年蝙蝠及胚源细胞系。另外，这些细胞也可以感染禽类、猪、鼠适应毒[20,21]。乙型流感病毒也可以在蝙蝠细胞中复制[19]。蝙蝠细胞能共感染2种不同流感毒株，并能产生重组病毒[22]。然而，H17N10和H18N11 BIV的重组潜力可能是有限的，因为病毒基因和包装信号与非蝙蝠流感病毒是不相容的[20]。由此可见，虽然包括我们在内的实验室证明蝙蝠细胞可感染流感病毒，但在自然情况下却不得而知[8-10,34]。若是可能，由此产生的重组病毒将改变宿主范围，且致病性相对会更强。

3 HA功能

流感病毒HA参与粘附和入侵[23]。HA以三聚体形式镶嵌在病毒子表面。HA在翻译修饰时，在茎部切割成HA1和HA2两个亚基。受体结合位点（receptor binding site，RBS）在HA1的球状头部，识别唾液酸受体粘附靶细胞表面，而HA2的功能主要发生在融合和入侵的过程。不同物种间不同的唾液酸受体结构是跨物种传播的主要障碍之一。禽类主要存在α2, 3唾液酸，哺乳动物主要存在α2, 6唾液酸[23]。HA识别不同唾液酸的能力造成组织嗜性不同、宿主间传播能力不同[24]。令人惊讶的是，对 H17和H18亚型BIV的HA（以下缩写为：BHA）分析时，HA不能识别唾液酸受体、天然唾液酸苷和超过600种多聚糖[4]。此外，重组H17N10 BIV无法粘附MDCK细胞（富含多种多聚糖，通常用来增殖高效价的流感病毒[25]）。这并不是因为蝙蝠细胞上缺乏唾液酸受体，当用人源流感病毒进行感染时，证明这些细胞表面存在唾液酸[19]。

BHA与其他HA蛋白的同源性仅45%[4,25]，H17和H18的HA序列之间同源性也只有60%，但整体结构与其他流感病毒的HA三聚体结构相似，并能形成易于识别的球形头部和茎部。HA的高度变异是选择正压所致，会引起免疫逃避[26]。BHA蛋白结构能帮助解释为何不能结合唾液酸。BHA受体结合位点（RBS）的结构与经典HA的有明显不同。经典的HA RBS形成一个浅结合穴，唾液酸两侧关键的结构要素有130-环、220-环和190-螺旋[27]。保守的芳香烃残基构成穴底，环和螺旋的关键氨基酸形成结合穴的边缘。穴边缘氨基酸残基差异导致了HA对不同唾液酸结构的识别差异。最近，在雪貂模型中，H5 HA这一区域的点突变与H5N1气溶胶传播直接相关[24]。然而，很多RBS边缘的关键受体决定性残基在BHA中并不保守。RBS几个额外的残基变化使该浅穴结构几乎完全消失，可能严重影响受体结合特性。对接模型预测显示：H17 HA RBS与唾液酸结构并不吻合[28]。BHA 130-环的136位天冬氨酸对唾液酸存在静电排斥现象。HA三聚体的其他结构改变也可能影响功能和稳定性，比如H17的HA茎部根部的融合肽不寻常地暴露在表面[25]。

4 NA功能

HA调节病毒吸附和入侵过程，而NA首要功能是参与病毒包装和释放。NA裂解存在于细胞或病毒颗粒表面的唾液酸，以防止HA结合感染细胞而导致的病毒粒子团聚。然而，蝙蝠流感病毒的NA似乎也不是典型的神经氨酸酶，因为无论是N10还是N11，对唾液酸酶底物或大量多聚糖并无作用[5]。

N10和N11蛋白复合体的晶体结构可解释底物特异性的不同[4,5]。一般亚型的NA亚基组装形成一种“盒状”胞外域的四聚体，并利用跨膜区插入到病毒脂质囊膜中。胞外域具有酶活性。N10和N11具有相似的球状结构，差异主要位于活性位点。一般在NA中参与底物结合和催化的残基，在N10和N11中鲜有相同。此外，稳定活性位点的二级折叠中的一些残基也不保守。150-环和430-环导致活性部位的上移，扩大了底物结合范围。出乎意料的是，在N10的150-环出现异常的链内互作，这在其他NA中不存在。

即便N10或N11的NA结构中形成比较大的结合袋，经典的唾液酸底物依然与该结合区不吻合[5,29,30]。神经氨酸酶抑制剂——奥司他韦与N1和N2活性位点结合，但却不能与N10的活性位点区结合，这一现象也验证了上述结论。相似的结构和可预测的不吻合亦存在于N11结构中[5]。变大的结合袋和150-环位置改变，这些对抑制剂结合有重要作用的影响因素[31]，不吻合导致神经氨酸酶抑制剂对蝙蝠流感病毒的NAs似乎并没有抑制效果。迄今为止，N10和N11的底物尚不清楚。在其他流感病毒中，HA和NA分别具有受体结合酶和受体破坏酶活性，而对于H17和H18，底物很可能却是一种尚未鉴定出的新型分子。抑或，蝙蝠流感病毒经过进化利用一种新型受体，而NA受体破坏酶活性可能就是多余的，而N10和N11可能在病毒复制期间发挥不同的作用。动物源，检测自然状况下蝙蝠感染的情况，对研究流感病毒的跨物种传播方式有着重要的指导意义，而这些病毒是否对人类健康构成威胁则显得更为重要。利用反向遗传学技术拯救蝙蝠流感病毒将有利于解释这些病毒的生物学特性和复制策略，尤其是研究BIV受体特性。虽然BIV的重组病毒还没有拯救成功，但是通过BIV节段的末端反向重复区组装成的H1N1流感病毒被成功拯救，使得这两个新亚型的生物学特性以及复制能力有了显著进展[32]。这些研究将揭示蝙蝠流感病毒是否在禽类和哺乳动物中产生遗传多样性。

5 NS1功能

NS1是流感病毒中最主要的多功能免疫抑制因子，在抗干扰素和其他多种先天性免疫途径中发挥了重要调节作用。H17N10亚型蝙蝠流感病毒的NS1（以下缩写为BNS1）替换PR8毒株的NS1，研究结果发现，重组BNS1的PR8抗干扰素活性显著被增强[32]。Hannah等[33]最近研究也表明BNS1可结合双链RNA，显著抑制天然免疫反应。H17N10亚型蝙蝠流感病毒与其他A型流感病毒的NS1具有50%同源性，但BNS1却极可能显示出更强的免疫调节作用。我们最近的研究也表明，BNS1明显具有抑制干扰素活性功能[34]。

6 展望

蝙蝠种类有1200多种，只有H17N10和H18N11两种新型蝙蝠流感病毒被发现。似乎有可能可以分离获得更多毒株，甚至可能还有其他亚型的甲型流感病毒[35]。同时，鉴定这些病毒是禽源或者是哺乳

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PROGRESSES ON NOVEL BAT INFLUENZA VIRUSES

XU Kai-di , CHEN Hong-jun

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Many hosts are susceptible to infuenza A virus infection. Recently, two novel subtypes of infuenza A viruses have been detected from bats, i.e. subtypes H17N10 and H18N11 of Bat Infuenza viruses (BIVs). Compared to other infuenza viruses, BIVs have unique replication features. From the analysis on virus evolution, novel infuenza viruses have been circulating in bats for a long time. A previous serology has detected a highly positive ratios in different bats. As a large number of bat species circulate in mammals (about 20 %), many unknown subtypes of Infuenza A viruses might replicate in bats. If these viruses have a potential to spread from bats to humans or other animals, the signifcance of public health will stand out as a big problem.

Infuenza virus; H17N10; H18N11; public health; bat

S852.659.5

A

1674-6422（2016）06-0075-06

2016-02-25

国家自然基金面上项目（31572502）；中央公益性单位专项经费（2015JB15）；中国农业科学院动物流感病毒病原生态学创新团队专项经费

许凯迪，女，硕士研究生，预防兽医学专业

陈鸿军，E-mail：vetchj@shvri.ac.cn