猪瘟病毒基因组遗传变异研究进展

杨德全，鞠厚斌，葛菲菲，刘 健，李 鑫，王 建，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

·综述·

猪瘟病毒基因组遗传变异研究进展

杨德全，鞠厚斌，葛菲菲，刘 健，李 鑫，王 建，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

猪瘟 (classical swine fever，CSF ) 是由猪瘟病毒 ( Classical swine fever virus, CSFV ) 引起的一种高度接触传染性致死性传染病，给养猪业造成重大的经济损失。本文概括了猪瘟病毒的基因分型，对猪瘟病毒与毒力相关基因进行了详细的阐述，分析了病毒的遗传变异特点，以期为猪瘟防控工作提供新思路。

猪瘟病毒；基因型；毒力；遗传变异

猪瘟（classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）感染猪引起的一种以高稽留热、出血坏死和高死亡率等为主要特征的高度接触性传染病。目前，我国的 CSF 呈现典型与非典型共存、持续感染与隐性感染共存等新特征，并在临床症状及病理变化上也出现了新变化，其流行特点及流行趋势又出现新的特点，危害依然十分严重，尤其是 CSFV 的变异又给 CSF 防控提出了新的挑战。因而，对 CSFV 的分子生物学进行研究，深入了解病毒的基因组结构、功能和遗传变异，对 CSF 的防控具有重要意义。本文就 CSFV 基因组结构、基因分型、毒力相关基因和遗传变异特点等方面作一综述，以期为CSF 防控工作提供新思路、新对策。

1　CSFV 基因结构

CSFV 基因组为单股正链线状 RNA 分子，长度约 12．5 kb，5' 端无甲基化的帽子结构，3' 端无 poly（A）结构。整个基因组由三个部分组成：两端分别是 5' 非编码区（5'-untranslated region, 5'-UTR）和 3' 非编码区（3'-untranslated region, 3' -UTR），中间仅有一大的开放阅读框架（open reading frame, ORF），该 ORF 编码一个由 3898 个氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶作用下，多聚蛋白在翻译的同时被加工成各种成熟的结构蛋白（C、Erns、El 和 E2蛋白）和非结构蛋白（N pro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B蛋白）。从 N 端到 C 端依次：N pro、C、Erns、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B蛋白。

2　CSFV 的基因分型

CSFV 遗传分型是追踪 CSFV 传播、变异以及持续性感染等极为有效的方法，有利于了解病毒的起源、分布和流行追踪，为流行病学的研究和对该病的防控提供参考数据。1996 年 Lowings 等[1]率先对世界上 20 多个国家的 115 株 CSFV 进行了序列比较、中和抗体反应性及内切酶分析后，将 115 株毒划分成 2 个基因群。其中，基因Ⅰ群下属 2 个亚群，包括 Alfortl87 株、Brescia 株、Thirverval 疫苗株以及20世纪60年代流行毒株；基因Ⅱ群下属 3 个亚群，包括 Alfort 株和 20 世纪 90 年代的流行毒株。在此基础上，Sakoda 等[2]1999 年通过对 40 余株流行毒的序列分析，将 CSFV 分为 3 个基因群：基因Ⅰ群以 Brescia 株为代表；基因Ⅱ群以 Alfort株为代表；基因Ⅲ群以日本、泰国和中国台湾等地20 世纪 70 年代～ 90 年代的流行毒株为代表，与其他 2 个基因群差别较大。德国学者 Paton 等[3]对全球多个国家 400 余株 CSFV 5' -UTR 150 nt 区域、E2 基因 190 nt 区域及 NS5B 基因 409 nt 区域核苷酸序列比对分析后，将 CSFV 分为 3 个基因群即基因Ⅰ群、基因Ⅱ群和基因Ⅲ群。其中，基因 Ⅰ 和Ⅱ型有 3 个亚群（l．l、1．2、1．3亚型；2．1、2．2、2．3亚型），基因Ⅲ型则有 4 个亚群（3．1、3．2、3．3、3．4亚型）。Postel 等[4]2013 年报道古巴的新分离株与基因Ⅰ型其他亚群同源性相对较低，应属于新的亚群（l．4亚型）。目前，这一分型方法，基本涵盖了所有己知的CSFV毒株，已成为国际公认的分型标准。

我国开展 CSFV 分子流行病学的研究工作较迟，近些年，已取得了相当大的进展。2004年涂长春[5]等对中国流行的 191 株流行株 E2 基因序列分析，显示目前中国大陆流行的 CSFV 分为2个基因群，4个基因亚群，即 2．1、2．2、2．3 和 1．1 基因亚型。目前尚未发现基因Ⅲ群毒株，基因Ⅱ群在我国属优势基因群，其中 2．1 和 2．2 基因亚群毒株是我国最主要的流行毒株。毛燕[6]对从广西省1986 ～ 2011年收集的 77 株 CSFV 进行 E2 基因序列分析，证明广西 CSFV 主要属于基因Ⅰ型中1．1亚群 和基因Ⅱ型中 2．1、2．2、2．3亚型，优势毒株为欧洲大陆的基因Ⅱ型中2．1亚型，仍未发现基因Ⅲ型。

由于 2．1 基因亚型存在较大的遗传多样性，进而又将其分为 2．1a 和 2．1b 基因亚亚型[7,8]。2009 年中国大陆首次在陕西省分离到1株 2．1a 亚亚型毒株[9]，王海光[10]2011 ～ 2012 年采集河北省、河南省和山东省等地种猪场临床健康猪的 400 份扁桃体，进行检测和病毒分离，分离到的11株病毒全部属于2．1a 亚亚型。Chen等[11]对 2004 ～ 2007 年采集自我国华南地区的 35 份CSFV阳性样品调查时发现，其中 34 份样品为 2．1b 亚亚型，只有 1 份采集于 2004年的阳性样品为 2．2 亚型。Jiang 等[12,13]调查结果显示在湖南省、广西壮族自治区和广东省等地区流行CSFV 2．1c 亚亚型的毒株。彭志成[14]对 2011 年来自广东省 11 个城市的 57 株猪瘟病毒流行毒株 E2 主要抗原区域编码基因序列进行系统进化分析，结果表明 57 株 CSFV 流行毒株中有 4 株基因型为 1．1 亚型，其它 53 株基因型均为 2．1 亚型，其中 2．1b 亚亚型 16 株，2．1c 亚亚型 31 株，2．1d 亚亚型 6 株。其中，2．1c和2．1d亚亚型毒株在广东省属首次报道，目前在该地区尚未发现2．1a毒株流行。Luo等[15]对2001～ 2009 年分离到的 31 株病毒的 E2 基因进行系统进化分析，11 株属于 1．1 亚型，13 株属于 2．1b 亚亚型，7 株属于 2．1a 亚亚型。在已报道的 4 个 CSFV 2．1 基因亚亚型 ( 2．1a ～ 2．1d ) 中，2．1b 亚亚型的流行范围最广[11,15]，为我国现阶段的 CSFV 优势基因群，但 2．1c 亚亚群病毒 2011 年后有上升的流行趋势[14]。随着流行时间的推移，2．1c 亚亚型毒株有可能代替2．1b 成为我国优势猪瘟病毒流行毒株。

3　CSFV 的毒力相关基因

目前，已经证实 CSFV 的 7 个基因（Npro、C、Erns、E1、E2、P7、NS4B）与 CSFV 的毒力相关[16]。Npro 基因与 CSFV 的复制无关，而与毒力相关。Mayer 等[17]将中等毒力毒株与强毒株的 Npro 基因缺失，均可使毒力减弱，致弱后的病毒均能诱导机体生成相应抗体并抵御强毒的攻击。

Gladue 等[18]为研究C 蛋白与细胞 IQGAP1 蛋白结合是否对病毒毒力有影响，对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ区进行碱基替换后，发现病毒在原代巨噬细胞上呈现出缺陷生长，体外对Ⅰ和Ⅲ 区碱基替换后，病毒的毒力完全减弱，这表明 C 蛋白与核内蛋白质IQGAP1 的相互作用对病毒的毒力相当重要。

Sainz 等[19]研究表明 Erns 上 N 端的糖基化位点也会影响到 CSFV 的毒力，将 N269 用 A 或 Q 替换后会降低病毒的复制能力，毒力减弱。Tews 等[20]研究发现，将 Erns RNase 活性区的 171Cys 突变，能够抑制同源二聚体的形成，从而导致病毒毒力减弱。

Risatti 等[21]在 Brescia 强毒株 E1 基因羧基端插入一段 19 个氨基酸残基的序列，获得的突变株 RBC22V 在猪原代巨噬细胞上表现出正常的生长特征，但将其接种猪后却表现出毒力的显著减弱，表明E1 蛋白羧基端区域与 CSFV 毒力有关。Fernandez-Sainz 等[22]利用点突变技术对糖基化位点进行突变发现，N594、N513 或 N594、N500 的双突变以及这三个糖基化位点的全部突变都会导致突变病毒不能在细胞内进行复制，突变除 N594 之外的任一或两个糖基化位点后并不影响感染细胞中病毒粒子的形成和病毒的感染力，但是，如果单独改变 N594 碱基或包含 N594 碱基在内的任何 2 个碱基都会使病毒的毒力减弱。这表明 E1 蛋白的糖基化位点也与 CSFV 的毒力有关。

E2 基因有一个 O-连接的糖基化位点和 6 个N-连接的糖基化位点，这些糖基化位点均与病毒毒力有关，并且对猪体产生保护性抗体和亚单位疫苗的研制具有重要作用[23]。Risatti 等[24]应用定点突变技术研究发现，Asn805 的糖基化对 CSFV 毒力影响最大，它的突变可导致病毒丧失毒力，在接种突变株后的d 3 和d 28可以抵抗致死性 BICv 毒株的攻击，表明 CSFV E2 蛋白 N-连接糖基化影响病毒在猪体内的毒力。此外，E2 蛋白上的抗原表位829TAVSPTTLR837 是影响猪瘟病毒毒力的重要位点[25]。Risatti 等[26]应用反向遗传技术用疫苗株 CS 毒株 E2 基因替换 Brescia 强毒株的 E2 基因，获得的重组病毒株 Brescia-（E2-CS）对猪的毒力明显下降，且在扁桃体内的复制能力降低，仅表现一过性的病毒血症。进一步研究表明，CS 株和 Brescia 株的 E2 C 端 882～1064 区域中有 13 个氨基酸的变异，这些氨基酸对病毒毒力致弱起关键作用，单个或多个氨基酸的替换对病毒毒力没有影响，只有替换全部氨基酸才会导致病毒毒力减弱[27]。由此可见，E2 蛋白对 CSFV 毒力影响很大。然而将编码结构蛋白的基因在 Brescia 株和 CS 株之间替换，获得的重组病毒的毒力却仍然保持着弱毒的特性，推断出 E2 蛋白只是CSFV 毒力的一个组成因素，其他蛋白对 CSFV的毒力也有影响。

Gladue 等[28]利用反向遗传技术证实， P7 蛋白不仅对病毒在体外的繁殖起关键性作用，而且对病毒的毒力也有重要的作用。

NS4B 蛋白中有一个假定的 Toll/白介素-1 受体样区域，该区域中有2个保守盒子区域（box1: 195IYKTYLSIRR204; box2: 228SVGIAVML235），这些保守区域的突变也能影响 CSFV 的毒力[29]。Tamura 等[30]对 GPE（-）疫苗株的致弱机制进行研究，结果发现 NS4B 与 E2 蛋白在病毒的复制效率和致病性方面具有协同作用，其中 NS4B 的 V2475A和 A2563V 2 个氨基酸的替换在 GPE（-）疫苗株特性改变方面具有决定性的影响，结果表明NS4B 对病毒的毒力至关重要。

4　猪瘟病毒遗传变异的特点

病毒的变异主要源于其基因组的突变和重组。猪瘟病毒基因组的突变主要集中在5' -UTR、3'-UTR、Erns、E2 和 NS5B 基因碱基序列的改变。根据 CSFV 基因组的功能上看，5' -UTR 与 3' -UTR 主要与病毒的复制有关，并且在属内高度保守；NS5B是参与病毒复制的依赖 RNA 的 RNA 聚合酶基因。Erns 和 E2 编码病毒的结构蛋白，能够刺激抗体或中和抗体的产生，集中了 CSFV 的大部分主要抗原表位。朱妍等[31]分析比较了 22 株流行毒株、石门株和疫苗株之间的抗原性，发现流行毒株之间存在的抗原差异性主要反应在 CSFV Erns 蛋白上，部分流行毒株发生了细微的抗原漂移。抗原表位的漂移可能产生逃脱特定抗体中和作用的突变流行毒株，从而影响疫苗的免疫效果，甚至有可能导致疫苗免疫失败。 E2 基因是 CSFV 全基因组中变异最大的部分，约为3．2%～25．0%[1]。赵耘等[32]对 22 株 CSFV E2 基因部分编码序列的分析表明，我国 CSFV 流行毒株向着远离疫苗株的方向变异，且呈现一定多样性。目前我国的 CSFV 流行毒株在 E2 抗原基因上存在着较大的变异现象。E2 蛋白结构的改变尤其是抗原表位的改变，可导致病毒逃脱抗体对它的识别，这是造成 CSFV 持续性感染的一个主要原因。

CSFV 重组可能改变 CSFV 毒力，并影响其遗传进化。贾琳等[33]对 50 株 CSFV 编码区全基因组序列进行选择压力和重组分析，结果显示，选择压力共检测出 14 个正选择位点，分布于 Npro、Erns、E1、 E2 和 NS5A 蛋白，都与宿主免疫应答有直接关系。重组分析的结果显示，重组区域所涉及的基因组主要编码与 CSFV 免疫和病毒毒力相关的蛋白，且重组的确改变了重组株所在的进化树分支；而蛋白 NS3、NS4A 和 NS4B 的编码区均没有发现重组痕迹，其遗传距离较短，进化程度较低，这些结果表明重组可能改变 CSFV 毒力，并影响其遗传进化。另外，C 疫苗株能够与流行毒株发生基因重组，从而产生新的未知特性的毒株[34]。当前所用的猪瘟活疫苗仍能诱导良好的免疫保护，能够抵抗不同基因型野毒的攻击，但随着时间的推移，CSFV 基因组突变的幅度将会加大，重组事件发生的频率将会增强，常规猪瘟疫苗的免疫效果可能会令人堪忧。因此，密切关注 CSFV 遗传变异特点很有必要。

5　结语

CSF 是长期以来困扰我国养猪业的主要疫病之一，当前，我国 CSF 的流行特点及流行趋势呈现出新的特点，危害依然严重，尤其是 CSFV 的变异又给 CSF 防控提出了新的挑战。目前中国大陆流行的 CSFV 分为 2 个基因群， 4 个基因亚群，即 2．1、2．2、2．3 和 1．1 基因亚群，其中2．1b 亚亚型的流行范围最广，为我国现阶段的 CSFV 优势基因群，但随着流行时间的推移，2．1c 亚亚型毒株有可能代替 2．1b 成为我国优势猪瘟病毒流行毒株。同时，需警惕近年来新发现的2．1d 亚亚型毒株也有上升的趋势。我国的 CSFV 流行毒株在 E2 抗原基因上存在着较大的变异现象。E2 蛋白结构的改变尤其是抗原表位的改变，可导致病毒逃脱抗体对它的识别，这是造成 CSFV 持续性感染的一个主要原因。此外，CSFV 重组可能改变 CSFV 毒力，并影响其遗传进化。因此，了解和持续监控 CSFV 的遗传变异动态，尤其应密切关注E2 抗原基因的变异，将有助于对 CSFV 感染和致病机制的深入化研究，为本病的有效防控乃至净化提供切实可行的技术支撑。

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ADVANCE IN GENETIC VARIATION OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS

YANG De-quan, JU Hou-bin, GE Fei-fei, LIU Jian, LI Xin, WANG Jian, ZHOU Jin-ping
(Shanghai Animal Disease Control Center, Shanghai 201103, China)

Classical swine fever (CSF), a highly contagious and often fatal disease of pigs caused by the Classical swine fever virus (CSFV), can lead to important economic losses in the pig industry. In this review, we summarized the most recent knowledge of molecular features of the genome, proteome, genotyping as well as molecular basis of virulence and genetic variation of CSFV.

Classical swine fever virus; genotype; virulence; variation

S852.659.6

A

1674-6422（2016）05-0081-06

2016-01-18

上海市市级农口系统青年人才成长计划项目（沪农青字（2015）第 2-6号）

杨德全，男，兽医师，主要从事动物病毒分子生物学研究

周锦萍，E-mail: shzjpvet@163．com