免疫学和分子生物学技术在猪传染性胃肠炎诊断中的应用进展

谢立兰，方六荣，方华为，张军林，安康，肖少波*

(1.武汉生物工程学院 应用生物技术研究中心，武汉 430415；2. 华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070)

免疫学和分子生物学技术在猪传染性胃肠炎诊断中的应用进展

谢立兰1，方六荣2，方华为1，张军林1，安康2，肖少波2*

(1.武汉生物工程学院 应用生物技术研究中心，武汉 430415；2. 华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070)

近年来，与猪传染性胃肠炎(TGE)类似的肠道传染病日益增多，以病理组织学观察和临床症状为主要指标的传统方法已不能进行准确的判断，众多学者建立了大量的免疫学和分子生物学新方法。文章就主要免疫学技术(病毒中和实验、酶联免疫吸附试验、胶体金技术)和分子生物学技术(反转录-聚合酶链式反应、反转录环介导等温扩增技术、基于纳米颗粒和DNA探针技术的超灵敏PCR方法)在TGE诊断中的最新应用研究进行了综述，以期为进一步防控该病提供参考。

猪传染性胃肠炎；免疫学技术；分子生物学技术；诊断

猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)引起的以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的传染病，是危害世界养猪业的重要疾病之一[1]。该病由Doyle和Hutchings于1946年在美国首次报道，几年之内在世界各个国家和地区均有发现。为此，各国学者对TGE的诊断方法进行了大量研究，并建立了病毒分离、荧光抗体技术、免疫电子显微镜技术、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、核酸探针和多聚酶链式反应等大量方法[2]。近年来，该病在我国的发病率呈上升趋势，疫区也逐步扩大，并与猪轮状病毒病、猪流行性腹泻混合感染，给养猪业造成了严重的经济损失[3]，国内学者对TGE的诊断特别是该病与其他肠道腹泻病毒病的鉴别诊断方法进行了进一步的研究，诊断方法主要集中于免疫学方法和分子生物学方法。本文就近年来诊断该病的免疫学和分子生物学技术进行综述，为进一步深入研究提供参考。

1 免疫学方法

1.1 病毒中和实验 Carbery等人于1969年根据病毒与相应的抗体结合后会失去对易感动物或细胞的致病力的原理建立了病毒中和实验(virus neutralization, VN)，该方法以直观性著称，长期以来被广泛用于多种病毒病的检测。然而，一些研究表明用中和实验检测TGEV抗体时，与猪呼吸道冠状病毒(porcine respiratory coronavirus, PRCV)抗体存在交叉反应，这可能是因为TGEV和PRCV的序列相似度较高，导致中和实验检测TGEV的特异性不强。此外，Nelosn等[4]比较了VN实验与ELISA试验检测TGEV抗体，当用细胞培养或肠道分离的TGEV感染猪并对其血清进行检测时，结果发现：ELISA检测阳性结果比VN 实验检测阳性结果分别早3 d和1 d，表明病毒中和实验的敏感性不强[5]。综上可见病毒中和实验在用于检测TGEV时表现出了特异性差和敏感性不强等缺点，因此限制了该方法在TGE诊断中的进一步应用。

1.2 ELISA试验 ELISA试验较之以往的血清学方法(如：VN实验)具有敏感性高、特异性强和可高通量检测样本等特点，是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法。周仲芳等于1997年率先以杆状病毒表达的TGEV 纤突蛋白(S蛋白)建立了阻断ELISA方法检测TGEV[6]，并进一步证实该方法可用于TGEV和PRCV的鉴别诊断[7]。Carmen等进而运用Svanova Biotech公司的TGEV/PRCV阻断ELISA试剂盒检测了大量样本，证实阻断ELISA方法用于TGEV的血清学检测方法可靠、简便[8]，奠定了该方法为进出口检验检疫中常用方法的重要地位。由于运用纯化的全病毒作为包被抗原建立的试剂盒[8]存在抗原获得量低，纯化困难等缺点，López等对鉴别TGEV/PRCV的阻断ELISA方法进行了优化[9]。PRCV与TGEV的唯一区别在于PRCV的S基因中缺失B、C位点，根据该原理利用杆状病毒表达S 蛋白建立的抗原捕获阻断ELISA方法检测TGEV，通过对600 份血清样品进行检测发现，其检测结果与单独检测TGEV和PRCV的已有商品话试剂盒100%吻合，对两种病毒检测的特异性分别达到100% 和92.06%[9]。近期，国内学者尹杰等人则以表达、纯化的TGEV S基因B、C抗原基因的重组蛋白作为诊断抗原建立了检测TGEV抗体的间接ELISA方法，该间接ELISA方法特异性和重复性良好，敏感性比血清中和试验高，有望用于TGEV的保护性抗体水平检测[10]。

由于已建立的阻断ELISA 商品化诊断试剂盒价格昂贵，不适于我国临床诊断的广泛应用[11]。近几年来国内学者对TGEV的ELISA检测方法进行了大量研究。基于病毒蛋白作为包被抗原的主要成果有：宋振辉等应用表达的重组TGEV衣壳蛋白(N蛋白)建立了间接ELISA方法[11]，通过对62 份血清样品进行检测发现，该方法与国外Svanova TGEV/PRCV试剂盒的符合率为93.5%。类似的，屈月[12]选用抗TGEV N蛋白的单抗和多抗血清建立双抗体夹心ELISA方法，该方法具有较好的稳定性和准确性，与其他猪病病毒反应无交叉性。另外，牟春晓等以S基因主要抗原位点A和D为基础建立了间接ELISA方法，该方法与纯化的TGEV包被的间接ELISA的符合率也较好[13]。另一方面，考虑到当前申报的TGEV抗体ELISA检测试剂盒均检测血清中IgG抗体，而分泌性免疫球蛋白A (IgA)在肠道黏膜免疫起着重要作用，是肠道免疫中的主要抗体分子，且韩国已经研制出了检测乳汁PED-IgA抗体的ELISA试剂盒。我国的蒋凤英[14]和闫贵伟[15]等分别以纯化的TGEV和重组的N蛋白为抗原建立了猪母乳抗TGEV IgA抗体检测方法，对TGEV阳性乳汁样品的最低检测浓度分别为1∶320和1∶160，弥补了猪传染性胃肠炎IgA抗体检测空白，具有较好的应用前景[15]。

1.3 胶体金技术 胶体金免疫技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术[16]。由于具有检测时间短、试剂和样本用量少等特点，胶体金免疫技术在生物学各领域得到了广泛的应用[16]。畅丹[17]和屈月[12]先后采用柠檬酸三钠法制备20 nm胶体金颗粒标记抗TGEV N蛋白的单克隆抗体(McAb)，并分别以纯化的抗TGEV N蛋白的多克隆抗体(PcAb)和羊抗鼠IgG作为检测线和质控线成功研制出了一种检测TGEV的胶体金免疫层析试纸条。该试纸条可检测100 TCID50的TGEV病毒培养液，且4 ℃密封保存90 d后仍能有效检测样品，适合于基层推广[17]。常亮等[18]通过优化胶体金的稀释液等措施对TGEV的胶体金快速检测条进行了改进，优化后的试纸条在常温下可保存1 年，并可检测出TGE病料中的TGEV，检测结果与韩国的商品化试纸条一致，有望用于生产实际。

2 分子生物学诊断

2.1 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术

2.1.1 RT-PCR RT-PCR 技术是将病毒RNA模板进行反转录，再以反转录产物进行PCR以检测病毒的方法[2]。早在1997 年，Paton等[19]根据TGEV和PRCV的S基因设计引物，成功建立了检测TGEV的最早的RT-PCR方法。李军等首次在国内对RT-PCR反应条件进行优化，建立了可检出1 pg TGEV RNA的RT-PCR方法，经过对56 份猪腹泻粪样的检测证实该方法准确、可靠[20]。此后，一些学者针对病毒的N蛋白基因序列也建立了检测TGEV的RT-PCR方法[21-22]，其中以王黎等报道的方法较好，其检测灵敏度可达pg级(10 pg)[22]。

2.1.2 多重RT-PCR 多重PCR是在一个反应体系中加入一对以上的引物以同时扩增多种靶序列的方法，自Chamberlain等人首次创立该方法以来[23]，已被广泛应用于多种病原微生物的同时检测或鉴定。由于与TGEV能够产生相似临床症状和病理变化的病原体较多，而如何在混合感染的样品中同时鉴定多种病原微生物显得非常重要，TGEV与其他肠道病毒的多重RT-PCR也获得了极高的关注。

Kim等首先建立了同时诊断粪便中TGEV和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的多重RT-PCR方法[24]，该方法可检测到10 TCID50的最低病毒载量。邹勇等[25]根据PEDV S基因、猪轮状病毒(porcine group A rota virus, RV) VP7基因和TGEV S基因序列分别设计了三对引物，建立了最早鉴别TGEV、PEDV和轮状病毒的三重RT-PCR方法，该鉴别方法简单、快速、特异性好，可检测到 1pg的TGEV RNA。Song等[26]使用与邹勇等[25]不同的三对引物对TGEV、PEDV和RV进行多重RT-PCR，并检测了2004年1月至2005年5月间韩国的157 份急性仔猪胃肠炎样品，再分别与单独检测三种病毒的RT-PCR结果比较，结果显示：该方法对三种病毒检测的特异性均为100%，检测TGEV的灵敏度可达100%。随后等多个研究小组均对检测PEDV、TGEV和RV的多重RT-PCR检测方法进行了进一步的探索和优化[27-29]。张坤等建立的多重RT-PCR方法敏感性较好，能够检测到35 pg的TGEV-PEDV-RV三联苗的混合RNA[30]，进一步应用该方法对华中地区75 份腹泻猪粪样进行的检测结果表明该方法的敏感性高、特异性强(检测TGEV的敏感性均为100%)，可用于腹泻样品中PEDV、TGEV和RV的检测[30]。焦洋[31]在国内首次建立了同时快速鉴别诊断PEDV、TGEV和猪博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV)的多重RT-PCR方法，经临床样品检测其检测PEDV、TGEV和猪博卡病毒的最高敏感度分别为20 pg、35 pg和10 pg，且特异性均良好，可以应用于临床检测。Zhao等[32]则建立了同时检测PEDV、TGEV、RV和猪圆环病毒2型(PCV2)的多重RT-PCR方法，其检测病毒敏感性分别为2.17×103、2.1×103、1.74×104和1.26×104拷贝，且特异性较好。2.1.3 巢式RT-PCR(RT-nPCR) 巢式RT-PCR又称套式RT-PCR，是在RT-PCR的基础上再设计一对或多对引物对模板进行扩增，进而可以提高反应的敏感性和特异性。检测TGEV的RT-nPCR方法由韩国学者Kim首创[24]，运用该方法可对TGEV和PEDV进行鉴别诊断，并可用于粪便样品的现场直接检测。韩国的Jung等人建立了多重RT-nPCR同时检测TGEV和PEDV，该方法对人工感染和自然感染猪的空肠组织中TGEV检测的结果与原位杂交技术完全吻合，且对TGEV的检测敏感度可达2.4×10-4TCID50/mL[33]。Salem等进一步建立的多重RT-nPCR成功的完成了TGEV/PEDV/RV的鉴别诊断，并运用该方法对127 份样品进行了检测[34]。2.1.4 荧光定量RT-PCR 传统的PCR技术因其不能对病毒核酸进行精准定量而只能进行定性分析，从而在很大程度上制约了PCR 检测标准的建立[35]。近年来，荧光定量RT-PCR方法因其具有定量准确、敏感性更高(可以检测到几个拷贝/μL的病毒核酸)、特异性更好等优点，在TGEV诊断应用中取得了较大进展[2]。Chen等[36]以Invitrogen公司的LUX ( light upon extension, LUX)引物为基础建立了检测TGEV的荧光定量PCR方法，其敏感性比常规RT - PCR方法提高了10 倍。白兴华等[37]首次以包含部分N基因序列的重组质粒为标准品成功建立了TGEV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法，该方法的检测敏感性达到15.3 拷贝/μL，优于Invitrogen公司的LUX引物法。此后，国内外多个课题组也陆续对检测TGEV的荧光定量RT-PCR进行进一步探索，并建立了多个检测灵敏度较高(检测灵敏度≤10 拷贝/μL)的快速检测方法[38-40]。

自Kim等[41]于2007年首次建立多重实时荧光定量PCR对TGEV和PEDV进行了同时检测以来，检测TGEV与其他肠道腹泻相关病毒的多重实时荧光定量PCR方法取得了较大的进步。陈小金分别以PEDV、TGEV、RV的ORF3基因、S基因和VP7基因为靶基因建立了检测3 种病毒的SYBR Green-I实时荧光定量 PCR 方法，最低检测下限分别为85、68和13 拷贝/μL，且特异性和重复性良好[42]。吴洋进一步对这三种病毒的多重实时荧光定量PCR进行了优化，检测的灵敏度上取得了很大进步，其检测TGEV的最低下限为32 拷贝/μL，已在临床诊断上具有重要意义[43]。

2.2 反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术 2000年，日本科学家Notomi等发明了环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，因该技术具有较高的敏感性与特异性，加之无须特殊仪器设备、操作简单、检测快速等优点，所以它已被广泛应用。RT-LAMP技术是LAMP技术的一种延伸。Li等首次将这种技术应用于TGEV的检测，作者首先根据TGEV N基因设计引物建立了RT-LAMP方法[44]，该方法可以区分TGEV、PEDV、RV和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)的感染，不需要高精尖仪器并且操作流程简单，易于推广。高睿泽进一步对引物进行优化，改进了TGEV的RT-LAMP快速检测方法，在63 ℃恒温下作用50 min，使TGEV N基因获得了高效率特异性扩增，可检测到131.4 fg/μL的目标，具有极高的灵敏性[45]。

2.3 基于纳米颗粒和DNA探针技术的超灵敏PCR方法(UNDP-PCR) 在动物疾病的诊断中常用的分子生物学方法还有很多，如核酸探针杂交技术等，该方法可以定性或定量检测特异的病毒核酸，在TGE的临床诊断中已取得较大进展[35]，并逐步建立了放射性标记探针(P32和S35等)和非放射性标记探针(生物素、辣根过氧化物酶和地高辛等)检测TGEV的两大类方法。在病毒感染早期，由于病毒尚未大量复制而导致样本中的病毒载量较低，当其病毒含量低于已有检测方法(如实时荧光定量RT-PCR等)的底线时将可能造成检测结果呈假阴性。Huang等于2014年根据生物条形码技术(Biobar code assay, BCA)原理，首次将磁性微粒、金纳米颗粒和核酸探针技术相结合建立了基于纳米颗粒和DNA探针技术的超灵敏PCR方法(ultrasensitive nanoparticle DNA probe-based PCR assay，UNDP-PCR)应用于PCV2的检测[46]。该方法是通过先将偶联有特异DNA探针的磁性微粒(Magnetic microparticles, MMP)与样品杂交从而富集样本核酸，即放大病毒的模板数量，得到MMP-病毒核酸复合体；再将包被有病毒特异性核酸识别标签的金纳米颗粒与MMP-病毒核酸复合体杂交，形成“三明治”模型，使样本核酸的信号得到第二次放大；最后，选择相应的方法把核酸识别标签洗脱下来并作为模板进行PCR扩增，由于被洗脱下来的核酸标签是待检核酸信号的放大，因此极大的提高了检测的灵敏度[46]。运用该方法检测PCV2病毒核酸的灵敏度为10 拷贝/mL，是普通PCR的近500 倍[46]。随后，该课题组又建立了同时检测PCV2和TGEV的多重UNDP-PCR方法[47]，该方法不仅使TGEV检测方法的灵敏度得到了更大的提高(可检测出的最低病毒量为20 拷贝/mL)，同时开创了同时检测DNA病毒和RNA病毒的超灵敏检测技术，相信该技术将会被迅速运用于不同病毒和不同领域的检测。

3 结语

综上所述，在对TGE的实验室诊断技术的研究中，近几年来集中于免疫学方法和分子生物学方法的研究成果较多。其中分子生物学方法因其具有高效、快速、准确等诸多优点而在实验室得到广泛应用，尤其是荧光定量RT-PCR，比普通的RT-PCR更敏感，特异性更高。但受到仪器设备的限制，分子生物学的诊断方法目前还无法应用于临床现地诊断。

近年来，免疫胶体金技术以其灵敏、特异和快捷等特点迅速发展起来，国外已开发出TGEV胶体金快速诊断试剂盒，方便快捷，非常适用于临床现地检测。我国建立的TGEV胶体金抗体检测试纸条在特异性、灵敏度和稳定性等方面都已取得很大进步，不仅能检测出病料中的TGEV，且对不同样品的检测结果与韩国的胶体金试剂盒一致[18]，非常适用于基层单位。因此，使诊断试剂商品化是我国今后发展TGE诊断技术的一个方向。同时，因为各种诊断方法都有其优点，也存在不足，在传统检测方法的基础上，多种不同诊断技术综合运用以进一步提高检测灵敏度和特异性也将是今后相关研究的一个重要发展方向。

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(编辑：李文平)

Progress on the Application of Immunology and Molecular Biology Techniques in Diagnosing of Transmissible Gastroenteritis

XIE Li-Lan1, FANG Liu-Rong2, FANG Hua-wei1, ZHANG Jun-lin1, AN Kang2, XIAO Shao-bo2*

(1.CenterofAppliedBiotechnology,WuhanInstituteofBioengineering,Wuhan430415,China; 2.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

With the increase of viral diarrhea of pigs, it’s difficult to make accurate diagnosis for transmissible gastroenteritis (TGE) by the traditional methods depending on pathological changes and clinical symptoms. In recent years, many scholars have done a lot of research about the diagnosis and detection methods of TGE, especially in immunological methods and molecular biology techniques. Accordingly, some immunological methods (virus neutralization, ELISA, immune colloidal gold technique) and molecular biology techniques (RT-PCR, reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, ultrasensitive nanoparticle DNA probe-based PCR assay ) developed in diagnosis of TGE were reviewed and summarized in the thesis, in order to provide reference for the prophylaxis of TGE.

transmissible gastroenteritis; immunological technique; molecular biotechnology; diagnosis

国家自然科学基金(31402181)

谢立兰，讲师，从事动物病毒分子生物学与免疫学研究。

肖少波。E-mail: vet@mail.hzau.edu.cn

2015-12-21

A

1002-1280 (2016) 02-0056-07

S852.65