新型猪瘟疫苗研究进展

于新友，李天芝，张 颖

(1、山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪群保健

新型猪瘟疫苗研究进展

于新友1，李天芝1，张 颖2

(1、山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种疾病，对养猪业危害极为严重，猪瘟疫苗的研制对于猪瘟的防治工作有着极其重要的意义程亚单位疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗及活载体疫苗等几种猪瘟新型疫苗的研究进展。

猪瘟；新型疫苗；进展

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病［1］，各种日龄猪均可感染，给世界养猪业造成巨大的经济损失［2］。国际兽医局（OIE）将其列为A类16种法定传染病之一［3］。疫苗接种是防控猪瘟的重要手段，为了预防和消灭CSF，减少经济损失，各国学者在CSF疫苗研制方面都作了大量的工作，现将近年来国内外CSF新型疫苗研究情况综述如下。

1　基因工程亚单位疫苗

是采用DNA重组技术，将外源病原体基因与适当质粒或病毒载体重组后导入受体（细菌、酵母或动物细胞），使其在受体中高效表达，提取所表达的特定多肽，加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗。Moormann等［4］研究了由昆虫细胞杆状病毒表达系统产生的CSFV E2糖蛋白亚单位疫苗的免疫效果和稳定性，结果显示，按32μg/头水包油型E2亚单位苗接种，3周后攻毒，保护率可达100%。汤德元等［5］构建了CSFV贵州流行株E2基因原核表达质粒pET-32a-E2，诱导表达目的蛋白，将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠，免疫后采血检测抗体，结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平。董炳梅等［6］在对E2蛋白（E2）进行N-糖基化修饰，并接种BALB/c小鼠评价免疫效果。结果显示，CSFV E2的糖基化修饰显著增强了DCs的抗原提呈功能，可以同时促进Th1与Th2免疫应答，但主要以Th2体液免疫应答为主，刺激机体产生了快而持久的抗体保护，并且具有良好的免疫记忆。李文良等［7］将重组杆状病毒感染Sf9细胞制备CSF E2、E0重组蛋白，单独或联合免疫家兔，并用CSF兔化弱毒疫苗C株攻毒家兔，检测免疫效果，结果显示，E2、E2+E0免疫组兔均可诱导产生高水平的抗体和中和抗体，且差异不显著。攻毒后E2免疫组2/5兔出现轻热症状，1/5兔脾脏病毒阳性；E2+E0组兔均未出现发热症状；E0组不能诱导兔产生中和抗体，但也能提供部分保护（2/5）。徐倩倩等［8］将构建了单独表达CSF E0基因和能融合表达E0与副猪嗜血杆菌Hsp70基因的重组质粒pColdI-E0和pColdIE0-Hsp70，获得了E0、Hsp70和E0-Hsp70融合蛋白，分别免疫BALB/c小鼠，检测免疫效果，结果显示，E0-Hsp70融合蛋白和E0+Hsp70混合物免疫后均能显著提高抗E0的抗体效价、CD4+和CD8+T细胞水平，并促进IFN-γ的释放。以上研究表明亚单位疫苗具有很好的免疫效果和很大的发展前景，值得进一步研发。

2　核酸疫苗

核酸疫苗是将外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在动物体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而产生免疫反应。Yu等［9］构建了含CSFV E2基因的4种真核表达质粒pcDSW、pcDST、pcDWT 和pcDWW，并分别转染BHK-21细胞，结果只有前2种分泌E2抗原，将pcDSW和pcDST分别进行动物试验，结果显示，pcDSW能诱导小鼠产生较高水平的抗体；且能对免疫兔和猪产生完全保护作用，pcDST效果则相对较差。李娜等［10］构建了应用甲病毒复制子载体表达CSFVE2蛋白的CSF疫苗pSFV1CS-E2，将该疫苗对猪进行免疫后，在攻毒前产生了低水平的中和抗体，攻毒后抗体水平迅速升高，除了个别猪体温短时间升高外，没有表现其他临床症状，剖检时未见任何病理变化。而空载体对照组的猪只均出现典型的CSF症状。邱元等［11］将CSFV E2基因和细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）片段插入真核表达载体pcDNA3.0内构建pcE2和pcE2-GF核酸疫苗，并进行动物试验，结果显示，pcE2和pcE2-GF第3次免疫2周后，免疫小鼠IgG抗体水平逐渐增高，淋巴细胞的转化率也明显增高，且pcE2-GF免疫组的IgG抗体水平和淋巴细胞的转化率高于pcE2免疫组。仇华吉等［12］构建了高效表达CSFVE2蛋白的腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体疫苗，该疫苗既能发挥腺病毒载体的高效转移外源基因的能力，又能发挥甲病毒复制子载体自我复制后高效表达外源基因及其诱导强大细胞免疫应答的优势，大大增强了疫苗的免疫效力，免疫剂量也大大减少，对猪只免疫后能诱导高水平的免疫反应，可以完全抵抗致死性CSFV强毒的攻击。

3　基因缺失疫苗

CSFV基因缺失弱毒疫苗是利用基因工程技术，对CSF兔化弱毒进行改造，使其缺失或替换某些与病毒复制无关的毒力基因，但病毒的复制能力并不丧失，同时还保持着良好的免疫原性。Widjojoatmodjo等［13］首先构建了表达CSFV糖蛋白E0的细胞系SK-6c26，在此基础上构建了可在SK6细胞上复制的C-株E0缺失突变株：FL22株（缺66个氨基酸）、FL23株（缺215个氨基酸）。该突变体疫苗对接触猪无感染性，不能引起病毒传播，安全性好。分别用两个突变株免疫试验猪，均可抵抗致死量CSFVBrescia株强毒的攻击，而且E0的缺失可用于感染猪和免疫猪的鉴别。deSmit等［14］构建了2株C 株E2基因突变株Flc9和Flc11。其中Flc9突变株是将C株E2基因C端由BVDV5250株同源部分替代，Flc11突变株是将C株E0基因被BVDV同源基因替代。将2个突变株一次免疫接种敏感猪，免疫1～2周后用强毒Brescia株或Behring株攻击，结果均能提供较好的临床保护。Van Gennip等［15］报道制备了3株C株E2基因突变株Flc4、Flc47及Flc48。其中Flc4缺失E2基因B/C区693-746aa，Flc47缺失E2基因A区800-864aa，Flc48缺失整个E2基因689-1062aa。这些病毒均可以在表达E2的细胞系中复制，以此3个突变株皮内接种免疫猪，结果Flc4能完全保护CSFV强毒致死性攻击，其他2个突变株仅能提供部分保护。Mayer等［16］构建了基于CSFV Alfort/187（中等毒力株）和Eystrup株（强毒株）的Npro基因缺失病毒，Npro基因缺失后毒力减弱。结果显示，这两株缺失病毒毒力大大降低但其复制能力和母本病毒并无差别。动物攻毒保护性试验结果显示，这两种突变毒株免疫猪后，均能刺激免疫猪产生可以抵抗致死剂量强毒攻击的抗体水平。Yang等［17］构建了3个E2基因缺失的感染性DNA，这3个缺失突变株均不能产生活病毒，表明E2的每一个抗原区对CSFV的生存都是必要的，但是这些缺失突变株接种猪后，均会产生不同程度的免疫作用，用血清学试验可以区别于正常毒株。

4　活载体疫苗

活载体疫苗是将外源病原体基因插入病毒或细菌弱毒株基因组或其质粒的某些部位使之高效表达，但不影响该疫苗株的生存与繁殖。接种后，除对原来病毒或细菌起保护外，还获得对插入基因相关病原体的保护力。de Smit等［18］将CSFV疫苗株的E2和Erns部分序列分别用BVDV相应区段替换，构建了两个镶嵌病毒（Flc2、Flc3），在免疫接种1～2周后，即可对猪产生较好的保护作用，检测结果还显示，重组病毒在兔和猪中均保留了父代C株的生物学特性和免疫原性。Reimann等［19］以BVDV弱毒CP7株为框架，通过反向遗传学方法用CSFV Alfort/187株的E2基因替换CP7株的相应区段，构建了嵌合病毒CP7-⊿E2PacI，接种后可以保护猪只抵抗CSFV的致死性感染。Lee等［20］构建了能表达CSFV E2蛋白的gD、gE双缺失的伪狂犬病毒重组疫苗，免疫接种试验表明，该活载体疫苗能使猪获得对伪狂犬病和CSF的双重保护。Ganges等［21］构建了能表达CSFV E2的重组猪痘病毒rSPV/ CSFV-E2，将该重组病毒免疫猪，进行攻毒保护性试验，结果显示免疫保护效果良好。徐义刚等［22］构建了能融合表达CSFVT细胞表位E290多肽和猪细小病毒主要保护性抗原VP2蛋白的干酪乳杆菌，并经口服接种途径免疫BALB/c小鼠，结果显示，小鼠粪便样品中可检测到抗PPV的特异性sIgA抗体，血清样本中可检测到抗PPV及抗E290的特异性IgG。王养会等［23］构建了表达CSFV石门株E0基因重组鸡痘病毒，将该重组病毒3次腹腔接种小鼠，ELISA检测血清抗体滴度高达1：4096，免疫猪3次之后，接种CSFV强毒进行攻毒试验，结果对免疫组产生75%的保护率。杨洋等［24］构建了含CSFV E2蛋白基因重组人5型腺病毒，并进行鉴定，重组腺病毒免疫小鼠后，可产生CSFV抗体。韩国全等［25］构建了猪霍乱沙门菌C500（S.C500）运载CSFV新型基因疫苗，口服免疫接种家兔，检测CSFV、S.C500特异性抗体；并用CSF兔化弱毒疫苗及猪伤寒沙门氏菌野毒株依次进行攻毒试验。结果显示，口服免疫家兔可以诱导产生抗CSFV和S.C500的特异性ELISA抗体，经三免后免疫家兔能够部分抵抗CSF兔化弱毒疫苗与猪伤寒沙门菌野毒株的攻击。许信刚等［26］构建了表达CSFV E2蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550（pYA3341-E2），并对重组菌表达的E2蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析、测定其在体内外的稳定性、生长曲线、安试验。结果显示，重组白且表达的蛋白能与C异性结合。在体外营养组菌株在体外可稳定地代繁殖，在体内可稳定淋巴结和脾。小鼠口服无毒性，安全可靠。动物口服重组菌免疫猪产生了抗E2蛋白抗体。淋巴细胞增殖试验表明，重组菌能诱导机体产生较强的细胞免疫应答。张小苗等［27］为研究表达CSFV E0-E2基因重组腺病毒疫苗（rAd-E0-E2）在兔体上的免疫原性，并确定其最小免疫保护剂量。将rAd-E0-E2按10倍梯度稀释为107.0IFU、106.0IFU、105.0IFU，分别免疫接种家兔，14 d后，用CSF脾淋苗对各组家兔进行攻毒。结果表明与对照组均不保护和CSF脾淋苗组全部保护相比，rAd-E0-E2在兔体的最小免疫保护剂量为107.0IFU。

5　展望

目前，注射疫苗是防控和净化CSF最有效的方法，传统的CSF兔化弱毒疫苗已不能满足防控和根除CSF的要求。新型CSF疫苗的研发及配套诊断方法的推出具有重要的现实意义，将成为有效控制CSF感染和规模化猪场净化CSF的重要手段。因此，各国专家、学者致力于新型CSF疫苗的研制，取得了一定的成就，这些新型CSF疫苗各有其优势，但也存在一定的缺陷。如亚单位疫苗需要多次免疫并配合佐剂才能提供有效保护，且生产成本高。核酸疫苗其诱导产生抗体的速度慢，接种剂量大，有整合和转化染色体的潜在危险。对病毒活载体疫苗，人类不完全了解病毒的自然发生及变异机制，无法控制该类病毒的未来走向，存在安全隐患。基因缺失弱毒疫苗因其毒力基因被人为地删除，往往不可能完全自行修复，故不会发生返祖现象，但弱毒疫苗的长期使用可能会改变CSFV原有的生态环境和病毒群落，使CSF流行毒株向远离疫苗毒的方向演化，这将给CSF的控制带来新的挑战。总之，无论是哪一种疫苗都不能作为控制并最终消灭CSF的唯一手段。相信随着分子生物学的发展，不久的将来会有更多价廉、安全、有效的新型CSF疫苗诞生。

［1］ 于新友，李天芝，王金良，等.基于Erns基因的猪瘟病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立和应用［J］.养猪，2014（6）：93-95.

［2］ 于新友，李天芝，苗立中，等.分子生物学技术在猪瘟野毒与兔化弱毒鉴别诊断方法中的研究进展［J］.猪业科学，2015，32（1）：76-78.

［3］ 殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997：652-664.

［4］ MOORMANN R J，BOUMA A，KRAMPS J A，et al.Development of a classica swine fever subunit marker vaccine and companion diagnostic test［J］. Vet Microbiol，2000，73（2-3）：209-219.

［5］ 汤德元，李春燕，罗险峰，等.猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究［J］.畜牧兽医学报，2011， 42（11）：1649-1653.

［6］ 董炳梅，谢金文，魏凤，等.猪瘟病毒E2蛋白靶向化树突状细胞疫苗诱导的BALB/ c小鼠体内/外免疫应答的研究［J］.中国预防兽医学报，2014，36（4）：305-309.

［7］ 李文良，毛立，杨蕾蕾，等.猪瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的协同免疫保护作用［J］.江苏农业学报，2015，31（2）：357-361.

［8］ 徐倩倩，张小敏，景娇，等.热休克蛋白70促进猪瘟病毒囊膜糖蛋白E0的小鼠免疫效果［J］.病毒学报，2015，31（4）：363-369.

［9］ YU X，TU C，LI H，et al.DNA-mediated protectionagainst classical swine fever virus［J］.Vaccine，2001，19（11-12）：1520-1525.

［10］ 李娜.基于甲病毒复制子载体的猪瘟DNA疫苗的构建及免疫效力评价［D］.哈尔滨：东北农业大学，2007.

［11］ 邱元，黄复深，陈尔曼，等.GM-CSF与猪瘟病毒E2基因共表达载体的构建及其诱导的免疫应答［J］.湖南农业大学学报（自然科学版），2007，33（2）：200-204.

［12］ 仇华吉，孙元，李娜，等.腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用：中国，101966341A［P］.2011-02-09.

［13］ WIDJO JOATMOAJO M N，VAN GENNIP H G，BOUMA A，et al.Classical swine fever virus E（rns） deletion mutants：transcomplementation and potential use as nontransmissible，modified，liveattenuated marker vaccines［J］.J Virol，2000，74（7）：2973-2980.

［14］ DESMIT A J，BOUMA A，VAN GENNIP H G，et al.Chimeric （marker）C-strain viruses induced clinical protection against virulent clas-sical sw ine fever virus （CSFV）and reduce transm ission of CSFV between vaccinated pigs［J］.Vaccine，2001，19（11-12）：1467-1476.

［15］ VAN GENNIP H G，BOUMA A，VAN RIJIN P A，et al.Experimental non-transmissible marker vaccine for classical swine fever （CSF） by transcomplementation of E（rns） or E2 of CSFV［J］. Vaccine，2002，20（11-12）：1544-1556.

［16］ MAYER D，HOFMANN M A，TRATSCHIN J D.Attenuation of classicalswine fever virus by deletion of the viral N（pro）gene［J］.Vaccine，2004，22（3-4）：317-328.

［17］ YANG Z，WU R，LI R W，et al .Chimeric classical swine fever（CSF）-Japanese encephalitis（JE）viral replicon as a nontransmissible vaccine candidate against CSF and JE infections［J］.Virus Res，2012，165（1）：61-70.

［18］ DE SMIT A J.Laboratory diagnosis，epizootiology，and efficacy of marker vaccines in classical swine fever：a review［J］.Vet Q，2000，22（4）：182-188.

［19］ REIMANN I，DEPNER K，TRAPP S，et al. An avirulent chimericPestivirus with altered cell tropism protects pigs against lethalinfection with classical swine fever virus［J］.Virology，2004，322（1）：143-157

［20］ LEE K S，SOHN M R，KIM B Y，et al.Production of classical swine fever virus envelope glycoprotein E2 as recombinant polyhedra in baculovirusinfected silkworm larvae［J］.Mol Biotechnol，2012，50（3）：211-220.

［21］ GANGES L，NUNEZ J I，SOBRINO F，et al.Recent advances in the development of recombinant vaccines against classical swine fever virus：cellular responses also play a role in protection［J］.Vet J，2008，177（2）：169 177.

［22］ 徐义刚，崔丽春，葛俊伟，等.猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌中的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定［J］.微生物学报，2007，47（4）：667-672.

［23］ 王养会，李谱华，张淼涛，等.表达猪瘟病毒石门株E0基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验［J］.病毒学报，2008，24（1）：59-63.

［24］ 杨洋，高博，宫婷，等.猪瘟病毒E2蛋白基因重组人5型腺病毒的构建及鉴定［J］.中国生物制品学杂志，2012，25（7）：805-808.

［25］ 韩国全，郭万柱，张博，等.猪霍乱沙门菌C500运载猪瘟病毒新型基因疫苗在家兔体内的免疫应答［J］.中国兽医学报，2010，30（12）：1561-1565.

［26］ 许信刚，王丹，童德文.表达猪瘟病毒E2蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株的构建及动物免疫试验［J］.中国兽医科学，2011，41（9）：901-906.

［27］ 张小苗，张恒，杨玉艾，等.表达猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒疫苗在兔体上的免疫原性分析［J］.动物医学进展，2015，36（9）：8-12.

2016-02-25）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-012-15）

于新友（1983-），男，山东菏泽人，执业兽医师，主要从事动物传染病诊断及防控研究.