自噬与骨肉瘤研究进展

鞠 杰 刘焕彩 王巧真 刘永新 王 箐 张雅雯 周风华 陈燕春

(潍坊医学院生物科学与技术学院,山东 潍坊 261053)



自噬与骨肉瘤研究进展

鞠 杰 刘焕彩1王巧真2刘永新2王 箐2张雅雯 周风华2陈燕春2

(潍坊医学院生物科学与技术学院,山东 潍坊 261053)

自噬；骨肉瘤；自噬相关因子

骨肉瘤是一种骨髓间充质来源的原发性恶性骨肿瘤，通常发生在长骨干骺端和膝关节周围，主要发生在青少年时期，成人呈现双峰年龄分布。通常采取多种方式联合治疗，包括辅助化疗、截肢与保肢重建手术。化疗联合手术治疗能够极大提高生存率，然而超过80%的手术治疗患者表现出转移〔1〕，患者预后极差。此外，化疗所带来的毒性和副作用严重影响了患者的治疗效果。当前自噬上调被发现存在于多种肿瘤疾病中，降低自噬可限制肿瘤生长〔2〕。因此，如何抑制骨肉瘤发展并降低治疗过程的毒副作用是一个亟待解决的问题。自噬是一个受到严格监管的溶酶体降解途径，在所有物种中高度保守。自噬能防止有害元件的蓄积，降解或者回收部分损伤细胞器及其他细胞产品，以保持细胞正常生长和分裂分化，维持代谢平衡及内环境稳定性〔3〕。研究表明，自噬基因的缺陷，增加了基因组不稳定性、丧失移除受损线粒体的能力进而产生活性氧，诱导肿瘤发生〔4〕。抑制自噬可提高目前使用的抗肿瘤药物及其他疗法的有效性〔5〕。本文将对自噬及自噬相关因子与骨肉瘤发生发展的关系做以下综述。

1 高迁移率族蛋白(HMGB)1调节自噬

1.1 HMGB1 HMGB1是结合于染色质胞外损伤有关的模式分子，是一种重要的自噬调节物质〔6〕。人类的HMGB1 有215 452个氨基酸残基组成，形成2个DNA结合域和1个C末端酸性尾巴。HMGB1在细胞核中以两种富含赖氨酸的形式存在于A盒和B盒中，是染色质的结构蛋白，在调节核内环境和基因稳定性发挥作用，维持HMGB1 A盒的氧化还原状态，可能会调节例如顺铂等药物的抗肿瘤活性〔7〕。HMGB1能与核小体转录因子以多种可逆方式相互作用，从而调控许多基因转录(例如：增加组蛋白和DNA作用，造成核小体整体结构改变)〔8〕。在内源性损伤过程中，HMGB1作为信号分子参与自噬，高度乙酰化的HMGB1在活性氧介导下以主动运输的方式从受损伤细胞向胞质内转移。核外HMGB1结合到细胞表面受体激活下游信号通路(例如：NF-κB和PI3K通路)，产生细胞黏附迁移，刺激增殖，诱导自噬等细胞学效应。研究发现，下调HMGB1可抑制癌细胞转移，在肿瘤的发生发展中起关键作用，HMGB1是治疗恶性肿瘤的潜在靶点〔9〕。

1.2 HMGB1调节的自噬与骨肉瘤 HMGB1有3个半胱氨酸，分别位于第23、45和106位。HMGB1的氧化促进了其定位于细胞外基质及其后的自噬过程。相比于正常组织，活性氧和自噬在癌细胞中都会发生改变〔10〕。Tang等〔11〕研究说明HMGB1向胞质转移对于维持和促进自噬是必须的。在HMGB1的3种半胱氨酸突变形式中，对氧化敏感的是半胱氨酸的第106位(C106)突变，而不是第23位(C23)和第45位(C45)突变。在两组独立试验中，C106突变体与野生型相似，然而C23和C45突变个体丧失了介导自噬的能力。因为突变的HMGB1不能结合到Beclin-1(Bcl-2作用卷曲蛋白)，无法终止Beclin-1-Bcl-2(B-cell leukemia/lymphoma 2)相互作用，Bcl-2家族的抗凋亡蛋白控制Beclin-1依赖的细胞自噬〔12〕。Piro等〔13〕研究结果也显示，与正常的骨组织相比，骨肉瘤组织中Bcl-2的活性增加，提示Bcl-2在肿瘤发生中发挥重要作用并且可以作为肿瘤活性的诊断指标。在敲除HMGB1的骨肉瘤细胞中HMGB1和Beclin-1相互作用被抑制。多项研究结果显示，Beclin-1基因在骨肉瘤中的表达明显低于正常骨组织，说明自噬在骨肉瘤中发挥重要作用。HMGB1在活性氧的触发下，转移到细胞外基质中，胞质中的HMGB1竞争性结合Beclin-1，在C23和C45作用下破坏Beclin-1同Bcl-2相互作用，HMGB1通过控制Beclin1-Bcl-2复合体解离与结合控制自噬进程。Beclin-1同Bcl-2的解离是参与激活自噬和控制凋亡的重要机制。HMGB1与Beclin-1正相互作用由ULK(ULK)调节，负调控由P53调节〔14〕。另外，上调的HMGB1与Bcl-2竞争性结合Beclin-1，促进Beclin-1/PI3kc3复合体形成，促进细胞自噬〔15〕。HMGB1的敲除抑制了在自噬体形成过程中LC3-II的表达，并且在MG-63细胞中抑制了LC3颗粒结构的聚集。超微机构分析显示HMGB1沉默的MG-63细胞在应用抗癌药物后仅有几个自噬体形成。利用P62形成的蛋白聚集会被自噬降解的特点，用P62测定自噬通量，HMGB1敲除的MG-63细胞抑制了P62降解，这些均显示HMGB1调节的自噬在骨肉瘤发生发展中发挥重要作用〔16〕。

内源性HMGB1促进自噬进而影响药物治疗，3-甲基腺嘌呤(3-MA)是自噬的抑制剂，阻断自噬体形成并且抑制自噬依赖的蛋白质降解，敲除Beclin-1或使用3-MA通过抑制自噬使得骨肉瘤对药物更加敏感〔17〕。3-MA和顺铂(DDP)共同处理的MG-63细胞增殖抑制率明显高于DDP组，说明骨肉瘤对药物敏感性增强可能是通过下调自噬实现〔18〕。HMGB1介导的自噬也是骨肉瘤产生抗药性的主要原因，在体内外研究中均发现HMGB1和自噬抑制都能增加骨肉瘤对药物的敏感性。粘着斑激酶家族相互作用蛋白(FIP)200是一种ULK 结合蛋白，HMGB1和Beclin-1的相互作用需要ULK1-FIP200复合物的参与，并且促进了Beclin-1-PI3KC3复合物的形成和自噬的进展。在野生型骨肉瘤细胞株中，雷帕霉素预处理能保护阿霉素诱导的细胞凋亡，然而雷帕霉素很少保护HMGB1敲除的骨肉瘤细胞。过表达的HMGB1还能发挥抗凋亡作用。在HMGB1介导自噬研究中发现骨肉瘤耐药性的新机制，这将为骨肉瘤耐药性的产生提供了新的治疗方法。

2 mTOR调节的自噬与骨肉瘤

在自噬的活性调节中，mTOR 是调节自噬信号途径的关键信号分子，目前国内外对mTOR信号途径在骨肉瘤中的研究报道较少。mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR 信号通路由于处于生长调节的中心环节而倍受关注。mTOR 作为自噬启动阶段信号转导的上游调控因素，调控自噬相关基因的表达。mTOR 能够磷酸化ULK1和ULK2，阻止自噬的发展〔19〕。当位于细胞表面的酪氨酸激酶受体(RTK)和G 蛋白偶联受体(GPCRs)与相应的细胞外配体相结合就可以隔离磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的调节亚基并释放催化亚基，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化，转变为磷酸肌醇三磷酸(PI3P)。PI3P 是一个重要的细胞内信号，可以与许多具有同源性底物的蛋白质相结合，如磷酸肌醇依赖的激酶1(PDK1)和激活的蛋白激酶B(AKT)，PDK1与PI3P 在细胞膜上结合并使AKT磷酸化，激活的AKT可以使细胞核和细胞质中许多目标蛋白磷酸化，抑制mTORC1的激活，促进自噬发生〔20〕。

PI3K/AKT/mTOR信号途径抑制过度自噬，诱导细胞死亡，AKT是PI3K的下游效应物，mTOR是AKT的下游效应物，mTOR分为mTOR复合物1(mTOR Complex 1,mTORC1)和mTOR 复合物2(mTOR Complex 2,mTORC2)。mTORC1包括mTOR、Raptor和gβ1。mTOR和Raptor相互作用调节mTOR激酶活性〔21〕。研究发现，mTOR抑制剂与自噬抑制剂共同作用能通过抑制细胞凋亡途径进而有效地治疗骨肉瘤〔22〕。PI3K/AKT通路是mTORC1的主要调节物，在多种肿瘤细胞中参与细胞存活和抑制凋亡。激活的PI3K/AKT 参与人类骨肉瘤Saos-2 细胞系的凋亡抑制。生长因子通过PI3K活化或者AKT第473位丝氨酸残基磷酸化〔23〕。活化的AKT通过抑制Bcl-2第136位色氨酸残基磷酸化导致细胞凋亡。PI3K/AKT/mTOR信号途径抑制过度自噬，诱导细胞死亡，另一方面mTORC1能刺激受损或毒性蛋白自噬，上调细胞存活效应通过 mTORC2活化AKT〔24〕。此外，研究发现mTOR抑制物雷帕霉素靶蛋白使P62和微管相关蛋白1(MAP1)LC3水平明显升高，P62被认为是自噬和蛋白泛素化的标志，提示雷帕霉素可激活自噬，诱导MG63细细胞凋亡〔25〕。

3 Atg4B调节的自噬与骨肉瘤

在骨肉瘤中有两条主要自噬通路：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路和第三类磷脂酰肌醇激酶(Ptdins3K)通路〔26〕。mTOR通过刺激增强Ptdins3k的活性，抑制ULK1/2(mammalian orthologs of yeast Atg1)复合体形成。mTOR抑制剂雷帕霉素在脑胶质细胞瘤中诱导自噬介导的细胞死亡。Ptdins3K 合成三磷酸磷脂酰肌醇，在自噬体形成的过程中给自噬相关基因(Atg)提供了一个结合位点。这两种途径通过调节Atg4或者Atg7的活性调控微管相关蛋白1 轻链3B(MAP1LC3B)脂质体形成。Atg4B是LC3B的主要激活物，Atg4B对于催化LC3B羧基端裂解具有最高的催化活性〔27〕。Atg4B和LC3B对于维持和增强自噬是必不可少的。一旦LC3B羧基端的甘氨酸暴露给Atg4B，Atg7在腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)依赖性激活LC3B并传递给Atg3，这使得LC3B结合到磷脂酰乙醇胺，实现LC3B的脂化。脂化的LC3B锚定这些自噬蛋白形成自噬体，并通过这种方式促进膜膨胀扩张自噬体，以此提高自噬强度〔28〕。脂化的LC3B或者在自噬体内被降解或者被Atg4B切割，或者重新回收利用。Atg4B激活LC3B的脂化并且回收脂化的LC3B，使其成为游离状态。LC3B在脂质体形成中必不可少，并且影响到自噬泡大小和沿微管的运输〔29〕。Atg4B提供给细胞足够的LC3B扩大自噬，并回收LC3B脂质体，维持自噬，这可能与骨肉瘤治疗过程中抗药性的产生有关。在缺乏氨基酸且沉默Atg4B的骨肉瘤细胞株中，沉默Atg4B的细胞株比对照组细胞更敏感，Atg4B对于骨肉瘤中的细胞生长有积极作用。在敲除Atg4B的Saos-2骨肉瘤细胞株中发现饥饿诱导的自噬缺陷。在缺乏氨基酸的培养基中，沉默Atg4B的Saos-2细胞死亡，在小鼠体内则表现为减缓肿瘤生长。Akin等〔30〕研究发现药物NSC185058抗肿瘤作用与影响Atg4B功能和抑制自噬有关，高浓度的NSC185058降低了Saos-2的细胞活力，然而在缺乏Atg4B的骨肉瘤细胞株不敏感，因此认为抑制自噬作用是Atg4B抗肿瘤作用的主要机制。

4 microRNA(miRNA)调节的自噬与骨肉瘤

miRNA是长度在18～25 nt的内源性非编码核苷酸，从线虫到哺乳动物保持高度同源性。miRNA在后期转录和调控翻译等生物学功能上发挥作用，miRNA几乎影响所有的生物进程，进而影响基因表达和细胞生长〔31〕。研究显示miRNA在调节细胞自噬进程中发挥重要作用，多种miRNA通过改变自噬参与骨肉瘤发生与发展。

4.1 miR-22与骨肉瘤 miR-22既可作为抑癌基因也可作为原癌基因。它在细胞生长、增殖、迁移、侵袭、衰老中起着十分关键的作用〔32〕。miR-22抑制核转录因子SPl、Sirtl(silent mating type information regulation 2 homolog 1)和CDK6(CDK6)的抗衰老作用而促进癌细胞衰老，也可抑制细胞生长、增殖和侵袭〔33〕。有研究显示在骨肉瘤组织中miR-22表达量较正常骨组织降低，miR-22表达水平与复发、转移也密切相关〔34〕。在转染miR-22的骨肉瘤细胞中，HMGB1 mRNA和蛋白质水平降低。应用抗肿瘤药物后，miR-22表达增加。过表达miR-22能够与HMGB1的3'端非翻译区配对，使得HMGB1表达下调，阻断自噬〔35〕。由此miR-22调控HMGB1诱导的自噬，并且在骨肉瘤的增殖迁移发挥重要作用。过表达miR-22抑制了细胞增殖和抗肿瘤药物处理的骨肉瘤细胞集落的形成，提示miR-22在减少骨肉瘤化疗期间抗药性产生具有异常的潜力。

4.2 miR-101与骨肉瘤 microRNA在许多细胞进程中是主要监管者，调节基因表达和包括自噬在内的生物进程。自噬的两个主要特征是酸性小泡(AVOS)的形成和由LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的高转化率，他们为LC蛋白的两种主要形式，对于自噬体形成发挥作用〔36〕。有研究显示在经过雷帕霉素处理后的骨肉瘤U-2 OS细胞株，Atg5含量明显升高，并且LC3-Ⅱ相比于LC3-Ⅰ含量明显增加。为了检测miR-101提高肿瘤细胞对药物的敏感性，Chang等〔37〕将miR-101转染U-2 OS 细胞株，发现自酸性小泡数量明显低于对照组，并且由LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化被抑制。自噬相关蛋白Atg5无明显变化，其他自噬相关蛋白表达降低，且噻唑蓝(MTT)还原法检测细胞活性，发现miR-101能够降低U-2 OS细胞活力。因此，miR-101阻断了由化疗药物引起的自噬，进而提高了骨肉瘤细胞对药物敏感性。研究发现，作为一种重要的自噬抑制物，miR-101能在肿瘤细胞中增强药物诱导的细胞凋亡，抑制肿瘤的迁移侵袭能力〔38〕。在成骨肉瘤Saos-2细胞和MG-63细胞中转染miR-101后，miR-101表达明显上调。miR-101过表达抑制了EZH2的活性进而抑制侵袭，并且易位的miR-101明显抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力〔39〕。林松等〔40〕用miR-101模拟物转染MG-63细胞，发现miR-101不但对骨肉瘤细胞增殖有明显的抑制作用，而且可促进骨肉瘤细胞凋亡，同时降低自噬相关蛋白Beclin1和LC3B的表达，提示，miR-101能通过调控自噬基因表达影响骨肉瘤细胞的增殖和凋亡。

5 结 语

HMGB1是自噬调节物质，通过影响PI3K/AKT/mTORC1途径，在抗药性产生过程中起重要作用。Atg4B抑制自噬发挥抗肿瘤作用，miRNA通过抑制和阻断自噬也能减少抗药性产生和对药物敏感性。骨肉瘤的发病是多种原因共同作用的结果。目前病因及发病机制仍不清楚，治疗方法主要集中在抗癌药物联合手术治疗，但治疗效果较差。发病机制的研究是治疗骨肉瘤的基础。若能够深入探讨自噬与骨肉瘤发病之间的关系，阐明自噬在骨肉瘤发生发展中的作用，将为治疗骨肉瘤提供新的思路。若能够通过调节自噬通路减少抗药性产生，提高肿瘤对药物的敏感性，将为骨肉瘤的治疗提供新的希望。随着发病机制研究的不断深入，必定会为骨肉瘤的治疗提供可能，人类在对抗恶性疾病的信心和技术是不容低估的，相信在不久的将来，骨肉瘤一定会为人类所克服。

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〔2016-02-01修回〕

(编辑 曲 莉)

国家自然科学基金(81401066)；山东省自然科学基金(ZR2012HQ021)；山东省教育厅课题(J12LK51，J13LK05)；潍坊市科学技术发展计划项目(201301074，201302089)

1 潍坊医学院附属医院 2 潍坊医学院临床医学院

陈燕春(1979-)，女，副教授，主要从事神经退行性疾病及骨肿瘤方面的研究。

鞠 杰(1994-)，男，本科生，主要从事神经退行性疾病及骨肿瘤方面的研究。

R738.1

A

1005-9202(2016)23-6024-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.111