NBQX对帕金森病模型大鼠内侧前额叶皮层锥体神经元电活动及5－羟色胺受体的影响

王　爽　高　捷　王　军刘　锐(西安医学院病理生理学教研室，陕西　西安　700)



NBQX对帕金森病模型大鼠内侧前额叶皮层锥体神经元电活动及5－羟色胺受体的影响

王爽高捷王军1刘锐2(西安医学院病理生理学教研室，陕西西安710021)

〔摘要〕目的研究6－羟多巴胺( 6－OHDA)损毁大鼠黑质致密部( SNc)后内侧前额叶皮层( mPFC)中锥体神经元电活动增强及5－羟色胺( 5－HT) 1A受体敏感性下降与AMPA/KA受体的相关性。方法应用在体细胞外电生理学记录的方法观察6－OHDA损毁大鼠SNc后，颈静脉应用AMPA/KA受体阻滞剂NBQX，进一步局部应用5－HT1A受体激动剂8－OH－DPAT后锥体神经元放电频率的变化。结果颈静脉应用AMPA/KA受体阻滞剂NBQX后，帕金森病( PD)组大鼠锥体神经元爆发式放电比例明显降低( P＜0．05)，放电频率无明显变化( P＞0．05)，进一步局部应用5－HT1A受体激动剂8－OH－DPAT后锥体神经元放电频率无明显变化( P＞0．05)。结论AMPA/KA受体阻滞剂对PD模型大鼠内侧前额叶皮层锥体神经元电活动增强有恢复作用; 5－HT1A受体敏感性下降可能与AMPA/KA受体关系不大。

〔关键词〕帕金森病; mPFC; AMPA/KA受体; 5－羟色胺1A受体

1西安交通大学第一附属医院急诊科

2西安交通大学第一附属医院肿瘤内科

第一作者:王爽( 1978－)，男，副教授，博士，主要从事神经退行性疾病的中枢机制研究。

帕金森病( PD)是由于黑质致密部( SNc)多巴胺( DA)能神经元进行性变性导致纹状体中DA水平显著降低，而引起整个基底神经节环路的功能紊乱，其主要的临床症状为运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势步态异常〔1〕。有关DA能神经元受损原因和PD发病机制的研究尚无定论。近年来研究发现，谷氨酸( Glu)的兴奋毒性在PD的发展过程中发挥主要作用〔2〕。Glu是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，其相应的受体主要分为两大类: iGluRs和mGluRs。iGluRs进一步分为N－甲基－D－天门冬氨酸受体( NMDA)，氨基－3－羟基－5－甲基异恶唑受体( AMPA)及海人藻酸( KA)受体，它们的活化导致相关离子通道的开放。而且本课题组以前的研究证明，5－羟色胺( HT) 1A受体对于在PD非运动系统症状中起重要作用，而AMPA/KA受体对于5－HT1A受体有无影响我们并不十分清楚〔3〕。本文通过研究内侧前额叶皮层( mPFC)锥体神经元放电频率的改变，探讨AMPA/KA受体与5－HT1A受体的相互影响。

1材料和方法

1. 1动物和药品雄性SD大鼠32只，体重220～300 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。大鼠在标准环境饲养，室温20℃～25℃，24 h昼夜循环光照，自由摄食饮水。大鼠随机分为:假手术组( n= 11)和PD组( n= 21)。实验所用6－OHDA、NBQX、8－OH－DPAT和地昔帕明均购自美国Sigma公司。

1. 2大鼠PD模型的建立采用6－OHDA化学性毁损单侧SNc中的DA能神经元，建立PD大鼠模型。术前3 d给予青霉素腹腔注射( 80 000 U/d)。大鼠用水合氯醛( 400 mg/kg，i．p．)麻醉后，将头固定于脑立体定位仪上。在6－OHDA注射前30 min，给大鼠注射地昔帕明( 25 mg/kg，i．p．)以保护去甲肾上腺素能神经元。常规消毒，剪开头皮，剥离骨膜，暴露颅骨，将颅骨前后囟调平(前后囟水平高度相差在0．2 mm以内)。根据Paxinos－Watson脑定位图对右侧SNc进行定位，坐标位置: AP:－5．0～5．3 mm; L: 1．9～2．1 mm; D: 7．1～7．4 mm。用微型电钻在颅骨上钻一个直径约3 mm的小孔，剥离硬脑膜。用10 μl的微量注射器与玻璃微电极相粘，尖端直径约50 μm，分两个位点在SNc内注射6－OHDA(手术前配制，4℃避光保存)。每位点注射4 μg/2 μl，总量8 μg/4 μl，给药速度1 μl/min，注射完毕后留置5～10 min，退出玻璃微电极，消毒止血后缝合伤口，腹腔注射青霉素80 000 U预防感染，待清醒后放置笼内饲养。假手术组大鼠注射等量的生理盐水，含0．02%的Vit－C，手术方法与PD组大鼠相同。

1. 3 PD模型大鼠的行为学检测术后第2周给大鼠颈部皮下注射阿朴吗啡( 0．05 mg/kg)，观察大鼠的旋转行为。若大鼠在药物注射后1～15 min出现向健侧旋转，旋转速度每1 min大于6圈，并且5 min内超过20圈者，表明PD模型成功。不出现旋转、向患侧旋转或旋转总圈数不足者则视为模型不成功，予以淘汰。

1. 4电生理学记录电生理学记录在SNc损毁后第3周进行。大鼠在4%水合氯醛( 400 mg/kg，i．p．)麻醉下行气管及静脉插管术后，头部固定于立体定位仪上，根据Paxinos－Watson大鼠脑定位图谱，确定右侧内侧前额叶皮层的坐标位置: AP: 2．7～3．2 mm; L: 0．1～0．6 mm; D: 1．5～2．5 mm。在冠状面与中线成2°角处倾斜进针，以避免损伤矢状窦。采用玻璃微电极细胞外记录法记录锥体神经元的放电，电极尖端直径1～2 μm，阻抗10～20 MΩ，充灌液为0．5 mol/L醋酸钠含2%滂胺天蓝。细胞放电经MEZ－8301微电极放大器，显示于VC－11记忆示波器，以观察电位波形、频率和细胞放电的形式，同时信号输入监听器监听。将信噪比大于3∶1的、稳定的单细胞放电经生物电信号采集与分析系统( CED1401 Spike2)输入计算机后，作实时观察、储存和进行频率及放电形式的分析。采样时间10～20 min。整个实验过程中监测大鼠的心电，直肠温度维持在( 37± 0．5)℃。

1. 5锥体神经元的确认mPFC中锥体神经元通常表现为缓慢的自发放电，频率0．1～5 Hz;动作电位的波宽＞1 ms;呈现不规则或爆发式的放电形式。

1. 6统计学处理采用SPSS13．0统计软件行方差分析及χ2检验。

2结果

与给药前比较，PD组大鼠静脉给予AMPA/KA拮抗剂NBQX( 2 mg/kg，i．v．)后锥体细胞爆发式放电频率由78．6%下降为43．65%( P=0．033)。与给药前比较，假手术组大鼠静脉给予AMPA/KA拮抗剂NBQX( 2 mg/kg，i．v．)后锥体细胞放电频率明显降低( P=0．021)，而继续局部给予5－HT1A受体激动剂8－OH－DPAT( 5 μg/100 nl)后则明显抑制锥体细胞放电频率( P= 0．001) ;而PD模型组大鼠静脉给予NBQX( 2 mg/kg，i．v．)后锥体细胞放电频率无明显变化( P = 0．935)，继续局部给予8－OH－DPAT( 5 μg/100 nl)后锥体细胞放电频率无明显变化( P=0．982)。见表1。

表1两组大鼠内侧前额叶皮层锥体神经元放电频率变化(±s)

与PD组比较: 1) P=0．021，2) P=0．001

组别　　给药前　　给予NBQX给予8－OH－DPAT假手术组( n=11)　 2．35±0．12　 1．25±0．071)0．57±0．072)PD组( n=21)　 3．68±0．16　 3．24±0．13　 3．05±0．13

3讨论

神经元均位于内侧前额叶皮层内，其电活动的特征符合锥体神经元的鉴定标准，属于锥体神经元。AMPA/KA受体阻滞剂对PD模型大鼠内侧前额叶皮层锥体神经元电活动增强有恢复作用可能与以下原因有关。首先，正常SNc中AMPA受体依赖部位的密度比NMDA高10倍。大白鼠SNc中主要存在AMPA选择性受体亚型，即Glu－R1－AMPA，GluR2/3，而无GluR4特异抗原决定簇。AMPA在PD患者SNc中的含量减少，但代谢型受体PD与正常人无区别。其次，GluR的兴奋毒性与PD的发生机理密切相关。其受体拮抗剂对MPP和6－OHDA引起毒性损伤均有保护作用，重复应用可延长其保护作用;说明Glu受体过度兴奋确实与PD神经元变性的发病机理有关。还有研究发现，长期应用左旋多巴治疗的PD大鼠模型中发现Glu水平的增加以及GLT－1 mRNA表达增加，推测这种GLT－1表达增加可能由细胞外高浓度的Glu导致的兴奋性毒性的保护性机制来发挥作用〔4〕。在PD鼠模型中应用Glu受体阻断剂或增加Glu的摄取都显示了明显的治疗效果〔5〕。本实验结果发现，AMPA/KA受体拮抗剂NBQX可以减少PD大鼠锥体神经元的爆发式放电比例，从神经电生理角度证明了Glu受体兴奋可能与PD发生有关。

颈静脉应用AMPA/KA受体阻滞剂NBQX后，PD组大鼠锥体神经元放电频率无明显变化，进一步局部应用5－HT1A受体激动剂8－OH－DPAT后锥体神经元放电频率无明显变化可能和以下原因有关:首先，本研究发现，PD模型大鼠锥体神经元电活动增强，5－HT1A受体敏感性下降;其次，本实验结果说明，AMPA/KA受体可能与5－HT1A受体敏感性下降关系不大，但仍需要进一步研究。

4参考文献

1 Cohen JD，Peristein WM，Braver TS，et al．Temporal dynamics of brain activation during a working memory task〔J〕．Nature，1997; 386( 6625) : 604．

2 Romanides AJ，Duffy P，Kalivas PW．Glutamatergic and dopaminergic afferents to the preferontal cortex regulate spatial working memory in rats 〔J〕．Neuroscience，1999; 92( 1) : 97．

3 Wang S，Zhang QJ，Liu J，et al．The firing activity of pyramidal neurons in medial preforontal cortex and their response to 5－HT1A receptor stimulation in a rodent model of Parkinson's disease〔J〕．Neuroscience，2009; 162: 1091－100．

4 Lee HK，Takamiya K，Han JS，et al．Phosphorylation of the AMPA receptor GluR1 subunit is required for synaptic plasticity and retention of spatial memory〔J〕．Cell，2003; 112: 631－43．

5 Robert S，Melon C，Guillet B，et al．Chronic L－DOPA treatment increases extracellular glutamate levels and GLT1 expression in the basal ganglia in a rat model of Parkinson's disease〔J〕．Eur J Neurosci，2004; 20( 5) : 1255－66．

〔2014－07－16修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目:陕西省科技厅青年基金资助( No．2011JQ4005) ;陕西省科技厅基金资助( No．2012KJXX－43) ;陕西省教育厅基金资助( No．2013JK0761)

〔中图分类号〕R338. 2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202( 2016) 02-0272-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2016. 02. 007