肝癌治疗新靶点GPC3研究进展

夏丽洁,张富春

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830046)



肝癌治疗新靶点GPC3研究进展

夏丽洁,张富春

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830046)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3, GPC3)在调控细胞生长和分化方面起重要作用,与肝癌的发生、发展密切相关。GPC3在肝癌组织中特异性高表达，从而提示GPC3对肝癌诊断具有明显的灵敏性和特异性，可作为肝癌治疗的新靶点。该文综述GPC3的结构功能及基于GPC3靶点的肝癌免疫治疗进展，并讨论其作为未来肝癌治疗靶点的前景。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；肝细胞癌；抗肿瘤；肿瘤标志物；免疫治疗；靶点

肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康[1]。在中国，由于存在较为严重的乙型肝炎病毒(HBV)感染等致癌风险因素，肝癌的发病率和死亡率态势尤为严峻。肝癌的治疗手段主要包括肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等[2]。由于肝癌特别是肝细胞肝癌(HCC)早期易发生转移以及治疗后易复发[3]，因此，寻找一个可以准确判断预后的指标和有效的肝癌治疗靶点具有重要意义。本文就磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican 3, GPC3)在肝癌中的最新研究进展作一综述。

1 GPC3的分子结构

GPC3是在研究过度生长综合症(Simpson-Golabi-Behmel syndrome，SGBS)时发现的蛋白聚糖家族成员[4]。GPC3基因位于人X染色体上(Xq26.1)。它的启动子区包括6个SPI结构、7个AP2结构和2个CAAT盒，产生2 130 bp的转录子，编码含580个氨基酸残基的GPC3蛋白质前体。GPC3核心蛋白相对分子质量约为70 ku，它富含一段包括14个半胱氨酸残基的独特序列，中间为furin蛋白酶切位点。Furin蛋白酶裂解Arg358和Cys359形成40 ku的N末端亚基和30 ku的C末端亚基[5]。在N末端有一种分泌型信号蛋白，C末端通过与糖基磷脂酰肌醇共价结合而锚定于细胞膜上，且硫酸乙酰肝素链插入点的位置均由C端最末50个氨基酸所决定，使该链靠近细胞膜[6]。

2 GPC3与肝癌

2.1 GPC3在肝癌中的表达 GPC3在调控细胞生长和分化方面起重要作用,与原发性肝癌的发生、发展密切相关[7]。研究表明，GPC3在HCC高度表达，而在成人正常组织不表达或低水平表达[8]，提示GPC3对肝癌诊断具有明显的灵敏性和特异性，可作为识别HCC特异性肿瘤标志物。Hsu等[9]通过对成对的HCC和非肝癌样品进行mRNA差异检测，发现有9～14个肝癌样本中GPC3 mRNA高表达，而在8个非肝癌样本中一个也没有检测到。此肝癌特异性进一步被证实通过Northern印迹分析数量有所增加的HCC样本，胎儿和成人正常组织，以及成人其他类型的肿瘤。来自191例患者中有143例(74.8%)的原发性和复发性肝癌样本GPC3呈现阳性，而另外154例中只有5例(3.2%)的非肝癌样本中检测到GPC3 mRNA的表达。GPC3与另一既定肝癌标志物甲胎蛋白(AFP)比较，根据113例原发性肝癌的分析表明，GPC3 mRNA表达的频率高于血清中AFP水平(71.7%vs51.3%)。当肿瘤大小低于3 cm时，其差异甚至更明显。

通过使用Northern blot和原位杂交技术，发现GPC3 mRNA在正常肝组织、肝脏局灶性结节增生和肝硬化中是低表达或不表达。与此相反，GPC3 mRNA表达在30个HCC样本中有20个样本明显增加，并且在30个肝癌样本中有5个适度增加。与正常肝组织相比较，在肝癌中GPC3表达的平均增幅为21.7倍，与局灶性结节性增生(FNH)或肝硬化比较，表达增幅分别为7.2倍和10.8倍[8]。通过使用免疫组化染色和ELISA方法，发现GPC3在HCC过表达占72%(21/29)，并且53% (18/34)的HCC患者的血清中GPC3水平有所提高(151～2 924 μg·L-1)，但是健康人中无法检测到它[10]。

此后，越来越多的研究表明GPC3可用于HCC常规组织检查和潜在治疗靶点。Yamauchi等[11]开发的另外2个GPC3单克隆抗体GPC3-C02和A1836A，应用GPC3-免疫组织化学对良性和恶性肝癌病变进行病理学诊断。广泛的GPC3阳性染色用于观察肝母细胞癌和恶性肝细胞癌(47/56，84%)，GPC3的表达独立于HCC的分化和大小[11]。

Baumhoer等[12]使用组织芯片免疫组化技术研究4 387个来自139个肿瘤类别和36个非肿瘤和肿瘤出现前组织类型的组织样品。在非肿瘤性肝脏样本中，9.2%的GPC3表达被检测到(11/119)，癌前结节状肝脏病变GPC3占16%(6/38)，HCC中GPC3占63.6%(140/220)，表明GPC3可以区分非肿瘤和癌前肝病毒的HCC。此外，其他一些肿瘤也显示GPC3的表达，包括肺癌、鳞状细胞癌、睾丸非精原细胞瘤和脂肪肉瘤。

2.2 GPC3作为血清标记物 虽然GPC3是一种细胞表面标记物，由于其可从细胞表面释放到血清，可溶性GPC3可作为血清GPC3(sGPC3)被检测[13]。因此，sGPC3水平可间接评估GPC3在肝癌组织中的表达水平[14]。比较3种血清标志物的表达水平，GPC3、人宫颈癌癌基因(HCCR)和AFP蛋白，用于189个样本肝癌诊断(101例肝癌、40例肝硬化、18例肝炎和30例健康者)。结果发现，GPC3是最好的标记物。肝癌诊断使用26.8 μg·L-1为界限，GPC3有51.5%的敏感性和92.8%的特异性。HCCR达到了22.8%的敏感性和90.9%的特异性，如果界限设定为58.8 MAU·mL-1，使用199.3 μg·L-1为界限时，AFP的疗效和敏感性分别为36.6%和98.5%。在这3个标记之间没有明显相关性。3个标记物同时检测的灵敏度明显增加至80.2%，比单独检测AFP检出率高[15]。测量1 037例受试者(包括155例 HCC患者、180例慢性肝炎、124例肝硬化、442例非肝癌癌症和136例健康对照)血清中GPC3的表达，显示sGPC3平均水平在肝癌患者为(99.94±267.2) μg·L-1，明显高于慢性肝炎患者(10.45±46.02) μg·L-1、肝硬化患者(19.44±50.88) μg·L-1、非肝癌患者(20.50±98.33) μg·L-1和健康对照(4.14±31.65) μg·L-1[14]。除了全长GPC3，GPC3的N端部分(GPC3N)也可被切割并分泌到血清中，因此GPC3N片段也可作为血清学标志物。然而，GPC3N片段的血清水平在HCC与肝硬化和健康对照相比，全长蛋白质的检测值明显降低[16]。

2.3 GPC3在组织病理学诊断过程中的作用 GPC3在组织病理学诊断过程中也可作为辅助工具，以区分HCC和肝硬化，发育异常的小瘤和局灶性结节增生样结节。使用免疫组织化学和实时逆转录酶聚合酶链式反应研究59例直径小于或等于3 cm的肝癌患者，以及66例肝硬化患者和16例低级别发育异常结节患者，33例高级别异型增生结节和13例局灶性结节性增生样结节患者。结果发现，GPC3的表达在小肝癌中明显比肝硬化和其他类型的小局灶性病变高，这表明从预恶性病变到小肝癌的转变与GPC3的表达在大多数情况下急剧增加有关[17]。

Coston等[10]研究了107例肝癌、19例肝腺瘤(HA)、16例FNH和225例非人类肝脏肿瘤上皮细胞分化GPC3和CD34的表达。107例的肝癌中，94例表现为局灶性或弥漫性胞质GPC3染色，而所有HA和FNH的GPC3呈现阴性，225例非人类肝脏肿瘤上皮细胞只有7例差异表达GPC3。该数据表明，GPC3不仅来自非肿瘤肝上皮分化的差异化HCC，也是HA和FNH 的差异化HCC的一个非常特殊的标记物。在HCC中GPC3的表达与肿瘤的大小、分化或所处阶段，肝硬化背景存在或不存在，或与底层的病因不相关。许多其它研究同样表明GPC3在HCC高度特异性表达占70%～100 %，并且可以作为一个指标区分良性肝组织和肝癌[18]。

3 GPC3通过刺激致癌信号通路促进肝癌的生长

GPC3最初发现于SGBS综合征，一种罕见的X连锁过度生长疾病，其通过功能丧失的突变而引起。GPC3缺陷小鼠显示发育的过度生长和一些典型的SGBS异常。在转基因小鼠中，GPC3的过度表达抑制肝细胞增殖和肝再生[4]。

在细胞水平上，GPC3可用作共同受体或存储多种生长因子，包括Wnts、Hedge-hogs、成纤维细胞生长因子和骨有关形态发生蛋白，调节这些生长因子与它们的细胞表面受体的相互作用[19]。研究表明，细胞表面GPC3促进肝癌细胞的生长。慢病毒感染的肝癌细胞表达可溶型GPC3(分泌形式缺少GPI锚定结构域)具有较低的细胞增殖率，通过受感染的细胞分泌的可溶型GPC3蛋白可以通过与内源性细胞表面的GPC3竞争结合抑制细胞增殖[20]。此外，在肝癌细胞株HepG2、Hep3B、Huh-7和Huh-4中通过siRNA或shRNA沉默GPC3基因能抑制肝癌细胞增殖[21]。

最近的一项研究表明，GPC3的高表达可通过ERK激活促进肝癌细胞上皮间质转化(EMT)，EMT参与癌细胞的表型转移和药物耐受[22]。癌基因c-myc也可能有助于推测GPC3诱发恶性表型。在GPC3基因启动子区发现c-myc结合位点，c-myc的结合直接激活GPC3基因的转录。同时，GPC3也上调c-myc基因的表达，在肝癌细胞中c-myc基因和GPC3最终形成一个正反馈信号回路[23]。

4 靶向GPC3的免疫治疗

HCC是一种恶性程度高的肿瘤，许多研究人员正在寻找新的治疗这种致病性疾病的方法。迄今为止，多种抗GPC3的单克隆抗体已经研制，这些抗体可以在细胞和组织中特异识别GPC3蛋白，抑制肝癌细胞的增殖或诱导凋亡[19,24-25]。

人源化抗GPC3单克隆抗体GC33，识别GPC3肽的C端，作为单一药剂，已通过晚期或转移性肝癌I期临床试验[26]。GC33的作用机制是抗体依赖细胞毒性(ADCC)，以及GC33能带来细胞毒性浸润T淋巴细胞进入肿瘤组织。靶向GPC3的人重链可变区(VH)抗体(HN3)对肿瘤细胞的GPC3核心蛋白具有高亲和力，它既可结合GPC3的N端域，也可结合C端域，并独立于GPC3的HS链。HN3可抑制多种肝癌细胞模型生长，对肝癌移植瘤裸鼠也表现出明显的肿瘤生长抑制作用。HN3抑制肝癌细胞的增殖主要依赖于GPC3的功能性抗原表位[27]。通过GPC3肽(AA 510-560)免疫接种小鼠，通过流式细胞仪高通量组合筛选获得抗体YP7。YP7对GPC3具有皮摩尔级的亲和力，在进行免疫组化和蛋白印迹方面比商业抗体1G12更敏感。YP7在体内具有抗肿瘤活性，在体内肿瘤成像及抗体治疗方面具有巨大潜力[28]。

5 结论与展望

多激酶抑制剂索拉菲尼的问世，开启了肝癌分子靶向治疗的新时代[29]。然而，肿瘤信号传导是一个复杂、多因素、多途经和交叉对话的网络系统，阻断特异性的靶标可能会被其他异常分子克服而使肿瘤对该药物产生耐药性[30]。基于基因敲除和siRNA实验结果，GPC3并不是肝癌细胞的致死基因。因此，是否抗GPC3抗体可导致肿瘤完全消退还需进一步研究。现有研究表明GC33和HN3靶向抗体不能完全消除肿瘤，因此单独的抗体治疗不能足够有效地治愈肝癌。克服这个问题的措施包括与化疗药物(例如，索拉非尼已被批准用于HCC)相结合、改造抗体(如抗体-药物偶联物)、双特异性抗体(例如，抗GPC3/抗CD3)、嵌合抗原受体的T细胞治疗等。另一个问题是抗体治疗后GPC3表达的稳定性。治疗后存活的细胞可能会丧失GPC3的表达来获得耐药性。为了解决这个问题，未来对GPC3表达调控的研究是非常必要的。

GPC3有望成为治疗肝癌的新靶点，但是它的结构-功能关系尚不明确。因此，进一步研究与探讨GPC3的结构和功能将有助于发现新的更有效的具有肿瘤抑制活性的抗体，并在此基础上应用多靶点抑制剂或联合不同作用途径和机制的药物可能在未来肝癌治疗中取得更大的成功，也为开发更加有效的肝癌治疗药物和合理的治疗策略提供理论依据。

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Research progress of a new therapeutic target in hepatocellular carcinoma glypican-3

XIA Li-jie,ZHANG Fu-chun

(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Glypican-3(GPC3) plays very important role in the regulation of cell growth and differentiation in hepatocellular carcinoma(HCC).GPC3 is closely related to the occurrence and development of HCC. A dramatic elevation of GPC3 expression has been reported in a large proportion of HCC, which suggests that GPC3 is remarkably sensitive and specific to the diagnosis of HCC. GPC3 is a potential therapeutic target of HCC. This paper reviews the structure and function of GPC3, the progress of immunotherapy based on GPC3 of HCC, and discusses the prospect of therapeutic target of liver cancer in the future.

glypican 3; hepatocellular carcinoma; antitumor;tumor marker; immunotherapy; target

2016-07-09,

2016-08-13

国家自然科学基金资助项目(No 31500752)；新疆大学博士启动基金资助项目(No BS150241)

夏丽洁(1985-),女,博士,讲师,研究方向:分子免疫学,E-mail:xialijie1219@163.com;

张富春(1962-),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:分子免疫学,通讯作者,E-mail: zfcxju@xju.edu.cn

时间：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.004.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.002

A

1001-1978(2016)11-1486-04

R-05；R343.9；R344.5；R735.705；R977.6