NF-κB在类风湿关节炎中的研究进展①



NF-κB在类风湿关节炎中的研究进展①

姜申易鲁静

(中国医科大学附属第一医院风湿免疫科，沈阳110001)

①本文为国家自然科学基金面上项目(81172867)。

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性关节滑膜炎症为主要表现的自身免疫性疾病，损害关节软骨、骨、关节囊，严重时可导致关节畸形和功能丧失，目前病因及发病机制尚未完全明确。血管翳是引起关节破坏的病理基础，主要由新生血管、增生的滑膜细胞、炎性细胞及机化的纤维素构成，抑制血管生成的药物被证实可有效缓解RA的病情[1]。在RA患者滑膜组织可检测出高表达的活化的核因子(Nuclear factor，NF)

-κB[2]，NF-κB可被多种炎症因子激活，进而上调多种炎症因子，促进滑膜炎、骨和软骨破坏，抑制骨和软骨修复，促进血管翳生成。RA患者NF-κB基因表达过高，其负向调节因子基因表达过低，甲氨蝶呤可以通过影响lincRNA-p21基因降低NF-κB活性，而小干扰RNA可以进一步使NF-κB治疗更具有特异性。本文就NF-κB在RA领域的研究做一综述。

1NF-κB的分子结构

NF-κB因与B细胞中免疫球蛋白κ轻链增强子中的一个11碱基对序列(κB序列)的相互作用而被发现，随后在各种类型细胞中被发现[3]。它由高度保守的Rel蛋白质家族成员两两结合构成同源或异源二聚体结构。Rel蛋白质家族氨基端均有一个300个氨基酸组成的序列，名为Rel同源结构域(Rel Homology Domain，RHD)[4]。RHD中含有二聚体的核定位序列(Nuclear localization sequences ，NLSs)，二聚体在此处形成，此外DNA或NF-κB抑制剂(Inhibitors of NF-κB，IκB)也在此处与NF-κB结合。哺乳动物中，Rel蛋白家族包含5个亚基：RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p50；p105)、NF-κB2(p52;p100)。RelA(p65)、RelB、c-Rel含有转录激活结构域，所形成的的二聚体可以激活转录，p65/p50异源二聚体为最常见的存在形式。NF-κB1和NF-κB2被作为一个大前体合成，命名为p105和p100，分别参与NF-κB亚基的第二亚家族p50和p52的产生过程。这个过程由泛素/蛋白酶复合体通路介导，并涉及到包含锚蛋白重复序列的C端区域的选择性降解[5]。NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)不含转录激活结构域，所形成的二聚体可以抑制转录。尽管p50和p52的同源二聚体是NF-κB的转录阻滞剂，但它们通过与RelA、RelB或c-Rel形成同源二聚体参与靶基因反式激活[6]。

2NF-κB的信号通路

静止状态下，NF-κB与一种调节性蛋白家族，即NF-κB抑制剂IκB结合，形成NF-κB-IκB复合体，以无活性状态存在于细胞质中。IκB家族成员包括IκBα、IκBβ、IκBγ和Bcl-3。IκB对NF-κB活性的抑制作用的机制最初被认为是通过掩盖了NF-κB二聚体的核定位序列(Nuclear localization sequences ，NLSs)，使之不能发生核移位。近期有研究指出NF-κB-IκB复合体能够取代NF-κB的靶向DNA位点并将其转移回细胞质内[3]。细胞质中无活性的NF-κB需要在一些炎性细胞因子等刺激作用下才能被激活，发生核移位，主要通过以下两种途径。

2.1经典激活途径抑制性NF-κB激酶(Inhibitors of NF-κB kinase,IKK)复合体是一种多聚体蛋白，它的激活可以导致IκB的磷酸化。一旦磷酸化，IκB就被一种多聚体泛素连接酶泛素化，被蛋白酶体降解，p65/p50的核定位序列暴露，这时p65/p50发生核移位，连接到一系列启动子的同源DNA序列上，并募集诱导基因表达所需要的转录零件。

2.2非经典激活途径与经典激活途径不同，非经典激活途径主要由TNF超家族的B细胞活化因子(B cell activating factor，BAFF)、CD40L、淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)

-β和病毒蛋白Tax，激活NF-κB诱导激酶(Nuclear factor-κB inducing kinase，NIK)和IKKα，使p100发生磷酸化，继而泛素化并被降解成p52。p52再与RelB 形成二聚体，最终RelB/p52发生核移位，发挥转录功能[7]。

2.3激活的终止转录发生后，NF-κB活性的终止也是一个重要的调节步骤。最初的研究认为NF-κB活性的终止主要受IκB蛋白重复合成来调节，IκB与NF-κB重新结合促进了细胞核输出NF-κB[8]。但有研究发现在IκBα缺失的细胞株中，p65的转录活性仍能在后期降低，且能被蛋白酶体抑制剂抑制[9]。另有研究发现，由组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase-1，HDAC)取代组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)减弱了NF-κB与DNA结合的能力。转录共激活因子p300/CBP是NF-κB的主要乙酰化酶，具有HAT活性，可以乙酰化组蛋白的N末端，使启动子区域的DNA机构松散，促进下游基因表达，相反HDAC起抑制作用。此外，在NF-κB激活的后期,p65通过泛素化而被降解[10]。

3NF-κB的生物学功能

NF-κB是一种广泛存在于真核细胞的转录因子，活化的NF-κB发生核移位，与DNA增强子或启动子结合，发挥调节转录的功能。NF-κB对细胞增殖的调节具有双重作用，因能反式激活细胞周期蛋白D1和c-myc表达，可以促进细胞增殖，但又因为抑制增殖因子JNK的表达，也可抑制细胞增殖。NF-κB对凋亡的调节也具有双重作用：NF-κB的cIAP-1和cIAP-2靶点可直接缠绕和抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，发挥抑制细胞凋亡的作用，但又因为NF-κB能够促进坏死受体DR5、FAS配体、Bax的表达，也可促进凋亡[11]。

4NF-κB与RA

在RA患者滑膜组织可检测出高表达的活化的NF-κB。国内学者韩飞等[12]用RT-PCR法检测46例关节滑膜组织中p65、p50、NF-κB抑制因子等的mRNA表达，46例中RA患者17例，骨关节炎(Osteoarthritis，OA)患者24例，正常5例。结果发现RA组NF-κB 的表达及活化水平显著高于OA组和正常组。用原位免疫组织化学染色法检测p65的核表达，结果发现RA组p65活性系数显著高于OA组和正常组。这些结果表明在RA患者滑膜组织中，NF-κB及其调控基因的表达和活化水平显著增高。

在RA的病程中，众多炎症细胞因子参与了关节炎症反映、软骨破坏和滑膜血管翳的生成。NF-κB可以通过与这些炎症细胞因子靶基因启动子的κB位点结合，上调其转录水平影响RA的病程。活化的NF-κB上调TNF-α、白细胞介素(Interleukin，IL)

-1β、IL-6、IL-8、黏附分子、环氧化酶2等的转录水平，反过来TNF-α、IL-1β等炎症因子又可以激活NF-κB，进一步产生TNF-α、IL-1β等炎症因子加重RA进展。这些细胞因子中TNF-α和IL-1β在RA中发挥主要作用。TNF-α对RA的致病机制表现在以下几点：促进内皮细胞中产生黏附分子，导致局部炎症；刺激滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生前列腺素E2、胶原酶、金属蛋白酶等，促进滑膜炎、骨和软骨破坏，抑制骨和软骨修复；促进内皮细胞、成纤维细胞生长因子释放，促进血管翳形成；促使滑膜细胞、巨噬细胞、纤维母细胞和软骨细胞产生IL-1、IL-8及TNF-α本身而加重组织损伤[13]。IL-1β与TNF-α相似，也能促进滑膜炎、骨破坏，抑制骨修复，与TNF-α发挥协同作用，共同促进RA的进展。

NF-κB促进CD4+T细胞向Th1细胞分化。CD4+T细胞在被特异性抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)提呈致敏后分化为Tho细胞，Tho细胞又在IL-4调节作用下分化为Th1和Th2细胞，IL-4在Th分化调解中起重要作用。Th1细胞通过分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β和IL-17介导细胞免疫应答，引起前炎性细胞因子产生，RA正是以Th1介导为核心的免疫系统功能紊乱性疾病。有研究用染色质免疫沉淀法检测体内NF-κB对IL-4基因激活的关联性，证明了在T细胞激活作用中，NF-κB连接到IL-4的启动子上，直接影响IL-4转录，从而促进向Th1细胞分化[14]。NF-κB促进滑膜细胞增殖抑制其凋亡。有研究分离RA患者的滑膜成纤维细胞，用IκBα转染，腺病毒转染做对照，再用TNF-α刺激，用实时定量聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测是否TNF-α诱导的NF-κB控制了 FLIP在RA滑膜成纤维细胞中的表达。结果证明了TNF-α诱导的NF-κB控制了 FLIP在RA滑膜成纤维细胞中的表达，NF-κB促进了RA患者滑膜细胞的增殖，抑制其凋亡，进而导致滑膜增生，加重关节破坏[15]。

近期多项研究针对NF-κB寻求RA治疗的新靶点。为观察RA患者NF-κB及其相关基因表达水平与正常人的差异，Wang等[16]用RT-PCR检测RA患者和正常人NF-κB负向调节因子A20黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位基因 (Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene，MALT)

-1、MALT-V1、A20、NF-κB 基因的表达水平。发现与健康对照相比，RA患者A20表达更低，NF-κB过表达，MALT1 和 MALT1-V表达下降。RA患者MALT1 和A20、MALT1-V1 和A20正相关，MALT1和NF-κB、MALT1-V1和NF-κB、A20 和NF-κB具有负相关趋势。而MALT1、A20、NF-κB可能与异常T细胞活性相关。A20缺乏和MALT1紊乱在中国RA患者中广泛存在，这是RA治疗的一个新靶点。

为研究RA常用药甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)对NF-κB活性的影响，及其可能的作用机制，Spurlock等[17]对RA中长基因间RNA-p21 (lincRNA-p21)的表达、NF-κB活性，以及对MTX的应答进行研究。发现RA患者lincRNA-p21基础表达下降，NF-κB活性标志物磷酸化p65 (RelA)基础表达升高。与小剂量MTX组对比，未经MTX治疗组的lincRNA-p21表达水平更低，磷酸化p65表达水平更高。低水平lincRNA-p21有利于RA患者NF-κB活性。MTX通过一种DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA PKcs)依赖性机制增加了lincRNA-p21水平，从而降低了NF-κB活性的基础水平。

为探索NF-κB的针对性治疗，减少对非靶器官的影响，Zhou等[18]用6~8周雄性DBA1/J小鼠制备抗CⅡ抗体诱导的关节炎模型(CⅡ antibody-induced arthritis，CAIA)，用蜂毒肽来源的一种阳离子亲水亲脂性肽p5RHH与以NF-κB的p65亚基作为目标的小干扰RNA(small interfer RNA，si-RNA)结合，以非共价的自我装配成稳定的纳米复合物，使si-RNA免于失活。在CAIA模型建立第4天，给予小鼠平衡盐溶液、游离Cy5.5标记的零乱siRNA(scrambled siRNA)或p5RHH-Cy5.5标记的零乱siRNA的纳米粒。结果发现p5RHH-p65 siRNA抑制了炎症细胞因子表达和炎症细胞进入关节，防御了骨侵蚀，保存了软骨的完整性，它有效的抑制了早期炎症性关节炎，而不影响非靶器官p65表达，也不会在连续注射后引发体液应答。

5新的研究方向

IL-35作为IL-12家族的新成员，与多个免疫调控环节密切相关，在小鼠胶原诱导型关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)模型中可以减轻关节炎症状已被多次证实[19]。目前IL-35对RA非T细胞的影响尚未明确，国内学者黄斯斯等[20]对40例扩张心肌病患者进行检测，发现这些患者IL-35及EBI3mRNA表达明显低于正常对照组，且与纽约心脏病学会(NYHA)提出的心功能分级负相关，说明IL-35与血管生成可能相关。然而IL-35对血管生成影响的机制、信号通路尚未明确，是否可以用NF-κB信号通路解释其对血管生成的作用机制，是否可以从抑制血管翳形成这一新的角度来解释IL-35减轻CIA关节炎症状的原理，可以作为NF-κB在RA领域的一个新的研究方向。

6小结

NF-κB作为一种核转录因子，可以调节多种细胞因子、黏附因子、趋化因子、生长因子、氧化应激相关酶等的表达，在细胞分化、细胞凋亡、细胞黏附、炎症及免疫应答等方面影响RA的发生、发展。目前NF-κB在RA领域的研究已经取得了一些进展，然而针对NF-κB的靶向治疗还有诸多问题有待探讨。

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[收稿2014-12-01修回2015-01-12]

(编辑倪鹏)

通讯作者及指导教师：鲁静(1963年-)，女，教授，主任医师，博士生导师，主要从事类风湿关节炎发病机制方面的研究，E-mail:lujingtan@163.com。

作者简介：姜申易(1989年-)，女，在读博士，主要从事类风湿关节炎发病机制方面的研究，E-mail:jaddison@163.com。

中图分类号R593.32

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)01-0119-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.028