二乙基亚硝胺在小鼠诱发性肝癌模型中的应用

赵　彤，李　柏

(第二军医大学中医系，上海　200433)



综述与专论

二乙基亚硝胺在小鼠诱发性肝癌模型中的应用

赵彤，李柏

(第二军医大学中医系，上海200433)

【摘要】DEN二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)对人体和动物都存在剧毒性，即使是小剂量注射或口服给药也会造成严重的肝损伤。由于对啮齿类动物诱导肝脏病变的稳定性，DEN常用于观察啮齿类动物肝癌形成全过程中形态学的改变以检测其癌前病变。在应用DEN后小鼠产生的肝损伤会引起肝硬化和肿瘤，使其成为分析人类肝细胞癌的发病机制和过程的理想动物模型。然而，一些研究表明，二乙基亚硝胺的致癌作用可能与动物不同遗传背景，性别，年龄等其他因素相关。因此，本文通过对相关文献进行综述，以期建立稳定，成功率高，死亡率低的DEN模型，并对不同目的的实验提供参考。

【关键词】二乙基亚硝胺；诱发性肝癌；小鼠；模型，动物

肝癌是威胁人类健康的主要原因之一，在肿瘤致死率中排名第二[1]。原发性肝癌的发生是一个多病因、多阶段的结果，依次经历肝炎-肝硬化-早期肝癌-进展期肝癌-肝癌转移[2]。期间可能涉及各种致病因素[3-4]，如病毒性肝炎，酒精性肝硬化等[5-6]，从初始的病毒感染到临床检测出肝癌的平均间隔通常为20至40年[7-8]。啮齿类动物小鼠模型是广为应用的肝癌动物模型[8-11]。在诱发性肝癌模型中，DEN[12-13]、二甲基亚硝胺、四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)等物质是常用致癌诱导剂[14-15]。其中，DEN是一种归属于N-亚硝基的有机物质，可稳定诱导多种组织肿瘤，如肝脏，肺脏，胃和造血系统[16]。DEN造模可产生严重的肝损伤，具有致癌性，突变性和致畸性，最突出的表现是中性粒细胞浸润，广泛的小叶出血性坏死，肝细胞异常分裂，胆管增生，纤维化，和桥接坏死，并最终导致肝癌。但是有研究显示亚硝胺对于不同遗传背景，性别等的小鼠作用不一，给药时间和剂量的不同也可能影响实验结果。因此本文旨在通过总结既往文献研究，提出适用于小鼠的DEN使用方案，建立高效的DEN小鼠肝癌模型。

1DEN的作用机制

DEN作为N-亚硝基类物质的一种，是遗传毒性致癌物，通过比较基因组学分析，发现在DEN引起的肿瘤模型中的基因表达，与人类肝癌患者的肝癌组织类似且预后较差[17]。经典的DEN诱癌分为启动-促进-演变三个过程，诱导脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)损伤和突变以及肝细胞死亡。由于其急性肝毒性和致癌性，少量的DEN即可对小鼠产生不可逆的致癌作用。1963年的研究发现，从服用DEN的大鼠肝脏中提取核酸，发现其N7原子鸟嘌呤乙基化，这一发现在解释DEN诱癌的分子机制研究上是一重大进展[18]。随后的研究发现DEN最终在小鼠体内转化为可以导致DNA加合物形成的烷基化代谢物，形成活性中间体，这会导致甲基化大分子的形成。其中最关键的是DNA中N-7甲基鸟嘌呤和O6-甲基鸟嘌呤的形成，改变了遗传信息，从而形成启动细胞，在致癌过程中起到了启动作用。这一转化过程是通过与细胞色素P450酶类(包括细胞色素P4502E1)相关通路实现的[19]，其主要靶器官是肝脏，在小叶中心肝细胞活性最高，且这一途径与人类代谢途径相似。

DEN模型通常被认为是化学性诱导的肝癌模型，也有证据表明和炎症反应相关。DEN造成的肝细胞损伤激活肝巨噬细胞枯否细胞，产生肝有丝分裂原，如白细胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)，这会刺激残存的肝细胞代偿性增生[20]。DEN诱导的肝癌发生被认为是受炎症信号的影响，肝细胞IκB激酶β(inhibitor kappa B kinase β，IKKβ)损失，阻止核转录因子(nuclear transcription factor kappa B，NF-κB)的活化，增加DEN诱发的细胞死亡，从而增强致癌效果[21]。DEN也与肝细胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积累相关[22-23]，ROS是细胞有氧代谢的结果，正常情况下，细胞可以保持ROS和抗氧化剂如过氧化氢酶，超氧化物岐化酶和多种过氧化物酶等之间的平衡。受DEN的影响，微环境破坏，ROS增多，产生紧张状态，造成如脂质，蛋白质和核酸等大分子的直接损害，可能会导致DNA和其他亲核物质氧化损伤，这种机制会进一步加强DEN诱导的肝癌形成[24]。除干扰ROS和抗氧化剂之间的平衡外[25]，DEN还可通过影响细胞线粒体代谢，引起氧化应激和DNA损伤，从而导致癌变。DEN诱导的肝癌使肝巨噬细胞和CD8+T细胞增加，且与肿瘤相关的巨噬细胞与肝癌的侵袭相关[26]。

单次使用亚硝胺激活Ha-ras原癌基因的突变，但在后续给予慢性促进剂引发的肝肿瘤，后续其基因改变取决于促进剂的使用，如肿瘤强促进剂戊巴比妥钠会引起Ctnnb1基因的突变，编码wnt/β-catenin通路，使谷氨酰胺合成酶过表达，导致肝细胞氧化应激增加，由此产生肝细胞变性和结构变化。CCl4的使用则会增加内毒素水平，模拟更接近于临床大多数肝癌发生过程的微环境。且在DEN改变遗传信息，形成启动细胞后，如果中断干预，可能会导致肿瘤消退，无法形成癌性结节，因此在促进阶段是可逆的[27]。

2影响DEN小鼠肝癌模型的因素

2.1品系

不同品系的小鼠对肝癌的易感性不同[28]，如14个月龄的C3Hf系雄鼠、C3H系雄鼠和C3He雄鼠的发生率分别为72%、85%和80%，而C57BL/6J小鼠自然肝癌发病率均较低[29]。在DEN诱发的肝癌模型中，C3H/HeJ小鼠的肝癌发生率也较C57BL/6J 小鼠高20～50倍[30]。常见的用于DEN诱发肝癌模型的小鼠品系有BALB/c、 C57BL/6、ICR等，其中高敏感系小鼠包括C3H 和 CBA。中度敏感系有FVB、 SM/J、 P/J、 CE/J、 LP 和AKR/J，相对不敏感的品系有BALB/c、 C57BL/6、 129和SWR。但在DEN诱发的模型中，即使是相对不敏感品系的小鼠也会发生肝肿瘤，只是较敏感品系小鼠，会有2～3个月的延迟。

2.2周龄

年龄对于小鼠对DEN的敏感性也有一定的影响。一次性低剂量DEN致小鼠肿瘤的研究显示，幼鼠肝脏易发生癌变，且酶活性(比如DEN脱烷基能力)会随着小鼠年龄增长，大概在7 d到15 d时达到一个峰值。后期，代谢功能会随着年龄的增加而降低，且雌性小鼠比雄性小鼠下降更快，大概在出生后42 d达到一个平稳期。在已有文献中，低剂量DEN注射的造模方式，大多选择两周龄小鼠[31]，也可见文献选用两周龄小鼠时，注射低剂量DEN溶液后在小鼠饮用水中加入适量DEN等[32]。在选用4-6周龄小鼠时，大多进行多次注射/灌胃DEN或与CCl4等肝毒性药物合用诱癌[33-34]。

2.3性别

过去几十年的广泛数据显示，肝癌的发生率在人类和啮齿类动物中均呈性别依赖性，男性患病率显著较高。研究显示当小鼠多次长期接受DEN干预，100%雄性小鼠发生肝癌，只有30%的雌性小鼠发生肝癌。在雄性小鼠6周龄时行睾丸切除术或使用促性腺激素化学阻断剂，降低了肝脏肿瘤的发生率、多重性和瘤块大小，而对雌性小鼠进行卵巢切除或补充睾酮则显著提高肝脏肿瘤的发生率，这可能是因为雌激素抑制肝癌发生但是雄激素刺激肝癌发生，雌性小鼠对DEN诱发的肝癌具有抵抗性[35]。观察发现，雌性小鼠对其他化学毒性诱癌物引发的肝癌一般也不易发生。且有文献探讨发现，性别导致DEN诱发的肝癌发生率不同主要是因为不同性别在枯否细胞分泌IL-6上有差异，而IL-6的分泌是由雌激素介导的。因此，在IL-6基因敲除的小鼠中，并没有性别导致的DEN诱发的肝癌发生率的差异。

2.4给药途径

给药方式对于小鼠肝脏肿瘤的形成时间的长短有着不一样的影响，常见的方式有腹腔注射、灌胃、综合干预、饮食饮水添加DEN加部分肝切除等。Rignall等[36]对6周大的C3H/N一次性注射DEN(90 mg/kg)，27周后成瘤，但单纯DEN组小鼠成瘤率和瘤体大小均小于注射DEN后给予0.05%戊巴比妥钠组小鼠。Schneider等[37]对两周大C57BL/6小鼠一次性注射DEN(25 mg/kg)，24周时出现癌前病变，42周时形成肝癌。Santos NP等[38]对五周大的ICR进行浓度为35 mg/kg的DEN腹腔注射，一周一次，连续八周，在第8周时80%的小鼠出现肝组织学改变和增生性病变，如肝细胞坏死凋亡，水肿变性等，第22周后出现结节，第29周出现肝细胞腺瘤。不过在整个实验过程中都未发现肝细胞癌。Iatropoulos MJ等[34]对8周的C57BL/6小鼠进行每周一次50 μmol/kg的DEN灌胃，第一次灌胃后10周成瘤。Aleksic等[39]对6周大小鼠一次性注射(90 mg/kg)DEN并在两周后喂养含0.05%～0.07%苯巴比妥的饲料，32周时诱癌成功。Unterberger EB等在实验中进行了与Aleksic相同的诱癌方式，在第28周时开始出现肝细胞癌。Thuy le TT等[40]对4周C57BL/6小鼠饮水中喂予含0.05 mg/L(低剂量)或25 mg/L(高剂量)DEN溶液的无菌蒸馏水，高剂量组小鼠在第25周处死，低剂量组小鼠在第36周处死，高剂量组的肝细胞癌发生率为44%，低剂量组小鼠肝组织并未发现瘤块。刘勇[41]对20 g的C57BL/6 雌性小鼠进行300mg/kg的DEN注射,一周后再连续给3 d二乙酰基芴(2-Acetylfluorene，2-AAF)20mg/kg，然后将小鼠肝脏左叶从根部结扎并切除(34%肝脏切除)，再连续3 d用2-AAF灌胃，3周后处死小鼠存活率达到64.7%，肿瘤标志物以及原癌基因表达显著升高。

3使用注意

因二甲基亚硝胺对眼睛、皮肤的刺激作用，摄入、吸入或经皮肤吸收可能致死，接触可引起肝、肾损害，实验人员也应做好相应保护措施。含DEN的注射溶液的配置过程通常应在通风橱里进行，操作者需要戴两层密封的丁晴橡胶手套，防护服，呼吸防护(P3型口罩)和防护眼镜，且房间内应标记以限制人员入内。丁晴手套和注射器在使用后应当丢弃到危险废物容器。也有实验步骤[42]指出超额量的N-亚硝基化合物可以用添加了镍铝合金的碱性溶液来销毁。此外，实验动物的排泄物应当每天或每周作为危险垃圾处理。实验动物应与其他动物分开饲养。若出现意外情况下暴露，包括皮肤接触，吸入或针刺伤，都应采集操作人员3 mL尿液样本并储藏在-70℃的环境中用以监测亚硝胺代谢产物的情况。这可以对DEN的摄入量有大概的估计，并有助于进行危险分析。

4检测指标

DEN诱癌的发生，经过肝炎阶段、肝硬化阶段、癌前病变、癌变等病变过程，在应用DEN的过程中，组织学改变的特点是广泛中性粒细胞浸润，水样变性，增生，肝小叶中心广泛出血性坏死，胆管增生，纤维化，细胞核大小不均，双核细胞，假核仁，细胞凋亡，肝局灶性坏死和有丝分裂。此外，磁共振成像可使小鼠不受损伤的进行肝脏肿瘤发生发展的检测。肝癌前病变与正常肝组织在许多分子表达上不同，但并没有明确指南指出哪一指标最为敏感，常见指标包括药毒性代谢(细胞色素P450，环氧化物水解酶，G-谷氨酰转移酶，谷胱甘肽-S-转移酶胎盘形成)，能量代谢(葡萄糖-6-磷酸酶，糖原磷酸化酶)，溶酶体活性(β-葡萄糖醛酸酶)，细胞间交换(间隙连接蛋白34)铁代谢，以及细胞循环(细胞周期蛋白D，细胞周期蛋白E)等。

5结语和展望

DEN作为小鼠肝癌模型的经典诱癌药物，成功率高，靶向性好，操作方便，但是其造模时间长，小鼠的品系、小鼠的性别、用药的剂量和方式等都对模型的建立有所影响，且目前无统一的造模方式。在已有实验数据中，采用高敏感系雄性小鼠，并采取综合干预，小鼠肝细胞癌成癌率高，死亡率低，操作方便，是较为理想的造模方式。

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〔修回日期〕2015-12-25

[基金项目]国家自然科学基金项目(81503632)。

[作者简介]赵彤(1989-)，女，硕士生，专业：中西医结合。E-mail: zhaotong1024@ foxmail. com [通讯作者]李柏(1964-)，男，教授，博士生导师，研究方向：中西医结合防治肝癌。E-mail: libai9@l26.com

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2016) 01-0076-05

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.015

Application of diethylnitrosamine in induced-liver cancer mouse model

ZHAO Tong，LI Bai

(Department of TCM,Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

【Abstract】Diethylnitrosamine (DEN) is highly toxic to both human and animals, even the parenteral or oral administration of the smallest quantities results in severe liver damage. Due to the robustness of the induced hepatic alterations, the application of DEN in rodents has become an attractive experimental model for studies aimed at understanding the pathogenetic alterations underlying the formation of liver cancer. The liver injury induced by DEN in mice can cause liver cirrhosis and tumors, which makes it an ideal animal model to analyze the pathogenesis and process of human hepatocellular carcinoma. However, some studies have indicated that the carcinogenic effect of Diethylnitrosamine may be related to the different genetic background, gender, age and other factors. Therefore, this article reviews the relevant literatures, in order to establish a stable, high success rate, low mortality DEN model, and to provide references for different purposes.

【Key words】Diethylnitrosamine；Induced liver cancer；Mice；Model,animal