表观遗传机制和哮喘的发生①

幸　鹏　刘志刚　喻海琼　夏立新

(深圳大学过敏反应与免疫学研究所，深圳518060)



表观遗传机制和哮喘的发生①

幸鹏刘志刚喻海琼②夏立新③

(深圳大学过敏反应与免疫学研究所，深圳518060)

支气管哮喘是由多种细胞，特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的最常见的慢性气道炎症疾病[1]，易感者表现为反复发作性咳嗽、喘鸣和呼吸困难，并伴有气道高反应性的可逆性、梗阻性呼吸道疾病[2]。最近的数据表明，哮喘和过敏性疾病的患病率不断提高，过敏性疾病严重影响患者的生活、工作，同时也大大加重了患者家庭和社会的经济负担。在1942年，CH Waddington学者就首次提出“Epigenetics”，并描述表观遗传学主要研究基因型和表型之间的关系[3]，研究显示，支气管哮喘的发生与环境因素和遗传密切相关，而表观遗传调控在遗传和环境因素之间起着非常重要的媒介作用，是参与许多疾病发展的一个潜在调控机制，包括过敏性疾病。动物模型表明：环境因素，如孕妇吸烟或暴露于机械通风的排烟环境中可以改变胎儿基因的转录，进而影响胎儿肺的结构和功能。

表观遗传机制介导的基因组适应环境变化和表遗传学改变可以促进疾病表型的发展，且可以作为可遗传变异[4]。在Ivana V.Yang的研究中发现,长期暴露在污染空气、烟草烟雾等环境中的人群与其表观遗传标志的改变有密切的关联，同时也增加了发生哮喘的风险，表观遗传标志与细胞调节机制在空间和时间上的协同作用共同调节基因的表达水平[5]。DNA甲基化的异常，组蛋白修饰的失调以及microRNA的异常表达会影响参与免疫介导的肺部疾病相关基因的转录活性，这将影响T细胞的分化、增殖及肌成纤维细胞的活化，导致炎性细胞因子的过量表达和在细胞外基质的过度积累。表观遗传学主要是研究DNA序列没有发生变化而基因的表达却发生了可遗传改变[6，7]，这些遗传改变包括：DNA的甲基化、组蛋白的修饰和microRNA的异常表达等；总的来说，这三个主要的表观遗传机制都在不同水平上影响DNA和转录因子的结合、转录的稳定性、DNA的折叠、核小体的定位、染色质压缩以及基因沉默或激活[8]，这些调控机制都参与靶基因的转录后调控[9]。近年来，针对支气管哮喘与表观遗传标志关系的研究已有较多的报道，现综述如下。

1DNA的甲基化

DNA甲基化是表观遗传机制中第一个被确认和研究最广泛的机制[10]；也是目前在哺乳动物中发现唯一的对DNA本身的遗传编码的修饰[4]。作为最常见的表观遗传修饰形式，DNA的甲基化是调节基因组功能的重要机制，它可通过直接影响转录因子与DNA的结合而抑制基因的表达[11]，因此DNA甲基化的改变可以影响细胞因子等表达相关的基因，导致T细胞的分化及反应性发生改变，从而与免疫性疾病的发病机制密切相关。DNA甲基化在Th2细胞因子的表达和Th细胞的发育过程中起着重要的控制作用，Janson等人发现IL-4基因启动子发生去甲基化时，原始T细胞会向Th2方向分化[12]。真核生物的甲基化是CpG二核苷酸的胞嘧啶的第五个碳原子，以S-腺苷甲硫氨酸作为供体，在DNA甲基转移酶的作用下，添加上一个甲基基团而变为5-甲基胞嘧啶，从而引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA失去限制性内切酶的切割位点，以及DNA酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化、凝缩成团，最终失去转录活性[13]。DNA甲基化可通过下列途径使基因沉默：①5-甲基胞嘧啶伸入到DNA双螺旋的主沟进而干扰转录子与启动子的结合；②甲基-CpG集合区蛋白选择性的与甲基化的启动子结合形成复合物，阻断转录因子的结合部位；③启动子区甲基化CpG与甲基-CpG集合区蛋白特异性结合，后者再与组蛋白去乙酰基转移酶结合形成复合物，结果使核心组蛋白尾部去乙酰化，形成更加紧密的DNA包装，减少转录因子暴露其相应顺式元件结合部位[14]。一般认为，DNA的甲基化会引起基因沉默，对基因的表达起着下调作用，而DNA去甲基化则会解除基因沉默的抑制作用，对基因的表达起着上调作用，DNA甲基化及去甲基化，再加上组蛋白修饰作用，直接影响着基因的活化状态。

有研究表明，由于环境因素的作用，过敏性哮喘的患病率上升速度远远超过了人类遗传背景基因序列的变化，这样的环境刺激包括饮食和营养：膳食甲基供体和辅因子，如叶酸、维生素B12、B2、B6和锌，这些都是DNA甲基化所必需的，并且可以改变过敏性气道疾病的遗传风险[15]。其中，叶酸是嘌呤、嘧啶和氨基酸的合成等许多生物反应所必需的。在DNA的合成中，叶酸是脱氧尿苷酸甲基化为胸腺嘧啶所需要的，这也是正常细胞分裂所必需的。以5-甲基四氢叶酸状态存在的叶酸为SAM(S-腺苷甲硫胺酸)的结构提供必要的甲基供体，它也是DNA甲基化所需要的普遍的甲基供体。除了在DNA甲基化中的作用，叶酸还具有与哮喘和过敏性疾病相关的抗氧化作用[16]。其他的一些环境因素也会对DNA甲基化产生上调作用，如暴露于外源性化学物质、孕妇的行为、烟草烟雾和心理压力，尤其是孕妇产前暴露于烟草烟雾中与在胎盘、脐带血以及儿童整体的异常甲基化有密切关联。在Tamar等[17]人的研究中发现，哮喘发生途径中基因甲基化的改变与暴露在炭黑(是一种交通车辆污染物颗粒标志)和硫酸盐颗粒环境中有密切关联。Alan等[18]发现在儿童中，β-2肾上腺素受体(ADRB2)的5′非翻译区可以作为哮喘严重程度的一个生物标志物。Nadeau和他的同事在研究生活在相对污染的Fresno区和加利福尼亚环境相对清洁的Stanford区的哮喘儿童，发现暴露在空气污染更严重区儿童的叉状头转录因子P3(forkhead box P3)的DNA甲基化概率大大升高，并且其调节性T细胞(T-regulatory)受损[19]。值得一提的是DNA甲基转移酶抑制剂，例如:5氮-杂胞苷(Aza)，在卵清蛋白(OVA)致敏小鼠模型中能够通过增加调节性T细胞的数量，提示Aza具有治疗哮喘的潜在优势[20]。

2组蛋白修饰

组蛋白是真核生物染色质中富含正电荷的精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸的结构小分子蛋白质，包括核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4以及起连接纽扣作用的H1蛋白。DNA双螺旋链是由组蛋白紧密缠绕而形成的具有高度组织的染色质结构，富含正电荷碱性氨基酸的核心组蛋白与带负电荷的DNA具有高度亲和性，可以阻止转录因子进入启动子的结合位点，从而抑制转录。在组蛋白尾部特定的位点和残基上发生的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化通过调节RNA聚合酶Ⅱ和转录因子与DNA的结合，从而控制基因的表达。例如，组蛋白H3K4的三甲基化(H3K4me3)与转录激活强烈关联，然而，组蛋白H3K27的三甲基化(H3K27me3)常与基因沉默相关[5]。同样的，组蛋白N末端赖氨酸残基在组蛋白乙酰化酶的作用下被乙酰化使基因转录活化；而组蛋白N末端赖氨酸残基在组蛋白去乙酰化酶的作用下脱乙酰基导致基因沉默。由组蛋白甲基转移酶或组蛋白去甲基根据甲基基团的数目，可逆地调节组蛋白赖氨酸或者精氨酸的甲基化，有助于染色质的压缩或松弛[21]。Cheng-ye Li等[22]研究发现，与正常对照组相比，哮喘患者外周血中T细胞表达的T细胞衔接活化因子(Linker for activated of T cells,LAT)的mRNA有所降低。LAT启动子组蛋白的低乙酰化可以抑制LAT的表达和增强Th2的分化，而一种组蛋白乙酰化抑制剂——曲古抑菌素A可以促进LAT的表达并且抑制Th2细胞因子的产生。因此，LAT的表达对哮喘的发生也是非常重要的。

在哮喘患者中，组蛋白乙酰化可以通过能激活T细胞或者LAT的链接介质调节T细胞的活力(LAT是一种选择性诱导T细胞激活的关键膜相关的接头蛋白)。在OVA免疫的过敏性气道炎症的的大鼠模型中，其组蛋白H3和H4的乙酰化水平显著降低，且在mRNA和LAT蛋白水平降低的LAT上游区，H3K9二甲基化显著增加从而导致Th2细胞的极化。与此同时，用曲古抑菌素A(TSA)治疗能逆转LAT启动子区组蛋白H3、H4的低乙酰化从而加强了LAT的表达并抑制了Th2细胞因子的产生。此外在哮喘患中，T细胞活化的调控、组蛋白的修饰也可以通过血管内皮生长因子(VEGF)介导支气管血管的重塑。Clifford等人[20]发现相比于非哮喘平滑肌(HASM)细胞，哮喘病人平滑肌(HASM)细胞的VEGF 165b在mRNA和蛋白水平的表达量都增加了。目前很少有替代糖皮质激素治疗哮喘的药物，Cristan Herbert等[23]在轻度慢性哮喘和急性发作哮喘的小鼠模型中，对一种新的蛋白质药物(ISU201)评估发现，ISU201能显著降低气道上皮细胞中组蛋白H4的乙酰化。因此，ISU201是一种气道炎症和气道重塑的广谱抑制剂，可能成为替代或辅助糖皮质激素治疗哮喘的药物。

3MicroRNAs

MicroRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的长度约为20个核苷酸的非编码单链RNA分子[24]，其主要作用是通过干扰mRNA的3′端非编码区，从而在翻译水平上调节基因的表达。通过miRNA干扰的基因沉默是影响生物体的发育和内环境稳定的一种表观遗传机制[16]；MicroRNAs在哺乳动物细胞的增殖和分化起着重要的作用(在人类基因组中，大约有60%的mRNAs都是由miRNAs靶向调控的[24])，然而miRNAs水平上的异常变化会引起细胞功能的变化，进而诱发疾病[25]。miRNAs在调节免疫平衡中的关键作用也受到越来越多的关注，microRNAs在过敏性疾病、肿瘤和感染等疾病中起着重要的作用。过敏性气道疾病的特点是炎症细胞的浸润和呼吸道高反应性，最近的研究发现哮喘患者的miRNA表达谱已有改变，miRNAs水平的异常上调或下调是构成哮喘发生内在机制的重要组成部分。

Tsitsiou等[26]学者通过对重度和非重度哮喘患者外周血CD8+T细胞中miRNAs表达谱差异研究发现激活的外周血CD8+T细胞中miR-146a/b和miR-28-5p的表达显著下调，提示这与重症哮喘的发生密切相关。与对照组相比，哮喘组的miR-21、miR-106a、miR-221、miR-181a、miR-150、miR-146a、miR-146b等的水平增加，而let-7降低，这些miRNAs分别通过不同的靶点来调节炎症的发生，在实验性哮喘的模型中，miR-21是一个经常上调的miRNAs。已有文献报道它的靶点是IL-12p35，并能抑制IL-12p35表达，而miR-21的下调可诱导树突状细胞产生更多的IL-12和CD4+T细胞，以增加IFN-g和降低IL-4的量，因此，miR-21主要调节Th1与Th2的细胞应答[20]。Jude等[27]人通过荧光素酶报告基因分析，发现miR-140-3p也是一个下调miRNAs，它可以调节CD38的表达。Chilba等[28,29]学者通过关于miR-133a与支气管平滑肌(ASM)收缩研究发现：miR-133a的抑制剂能够促进支气管ASM收缩的一种重要因子-RhoA蛋白的表达，且IL-13能够通过STAT6非依赖的机制直接抑制人支气管平滑肌细胞表达miR-133a。也就是说IL-13可以通过下调支气管平滑肌细胞表达miR-133a从而促进RhoA蛋白的表达，进而引起平滑肌收缩[26]。所以上调miR-133a的表达为治疗支气管哮喘患者气道高反应提供了一种新思路。在哮喘患者的HASM细胞中，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导CD38的表达升高，而miR-140-3p诱导的CD38的表达则显著下降。这说明在HASM细胞中，CD38是miR-140-3p的一个靶点且TNF-α诱导表达CD38也是受到miR-140-3p的调节。根据这些miRNAs的作用靶点，在基因调节和疾病模式上，目前也有能力应用个体miRNAs作为治疗的手段，针对哮喘的气道高反应的miRNAs治疗可以达到抗炎症的反应[19]。

4结语

哮喘是一种与遗传密切相关的气道炎症性疾病，他的发病机制非常复杂，目前公认的机制涉及免疫学、内分泌、遗传学及环境学等。有越来越多的研究表明，表观遗传机制参与了哮喘和过敏性疾病的发展[15]。对表观遗传学进行研究，使其成为和环境暴露、药物及过敏性疾病发病机制之间相关联的桥梁，这可能寻找到研究哮喘的新通路。在不久的将来表观遗传潜在的修饰作用可以为降低过敏性疾病和哮喘发生找到新方法[30]。虽然哮喘的表观遗传学现仍处于起步阶段，尽管现面临更多的挑战，但是表观遗传分析提供了一个认识哮喘发生、发展和治疗的新平台。在当前临床医生面临激素抵抗性哮喘束手无策的状况下，利用miRNAs进行干扰哮喘的发生及治疗等方面的研究可能为支气管哮喘的防治提供新的治疗选择。

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[收稿2015-06-03修回2015-07-07]

(编辑倪鹏)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.036

作者简介：幸鹏(1990年-)，男，硕士，主要从事过敏反应与免疫学基础研究，E-mail:xingpeng_2005@126.com。

中图分类号R593.1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0757-04

①本文为国家自然科学基金(81273275)；深圳市科创委基础研究项目(No.JCYJ20120613173233810)。

②深圳福田人民医院，深圳518033。

③通讯作者，E-mail:xialixin@126.com。