KLF4在肿瘤中的最新研究进展

刘海霞，宋　晖，马　芮， 李　娜， 周福兴，陈必良

(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032)



【妇幼综合研究】

KLF4在肿瘤中的最新研究进展

刘海霞，宋晖，马芮， 李娜， 周福兴，陈必良

(第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032)

上皮锌指蛋白4(KLF4)是一个在多种组织中表达的锌指结构转录因子，包括肠上皮及皮肤组织，它在细胞变异及细胞周期停滞都发挥着重要作用。首先，根据靶基因功能，KLF4既可以激活也可以抑制转录作用;其次，在不同的细胞微环境中，KLF4既可以作为肿瘤抑制因子，也可以作为癌基因;再者，KLF4在重组已分化成纤维母细胞为类似胚胎干细胞的可诱导多能干细胞中发挥重要作用。该综述目的是总结KLF4的生物特性及其与肿瘤发生发展的分子机制最新进展。

上皮锌指蛋白4；肿瘤；增殖；分化；上皮间质转化

[Abstract]Krüppel-like factor 4 (KLF4)is a zinc finger-type transcription factor expressed in a variety of tissues, including epithelium of intestine and skin, which plays critical role in differentiation and cell cycle arrest. Firstly, KLF4 can both activate and repress transcription according to target gene. Moreover, KLF4 can be a tumor suppressor or an oncogene resting in different cellular context. Finally, KLF4 is important in reprogramming differentiated fibroblasts into inducible pluripotent stem cells, likely embryonic stem cells. The aim of this review was to summarize biological functions of KLF4 and the latest molecular mechanisms of tumor occurrence and development.

[Key words]Krüppel-like factor 4 (KLF4); tumor; proliferation; differentiation; EMT

Kruppel样因子(Krüppel-like factor，KLFs)是锌指成员转录因子，它包含C-末端三个C2H2型锌和N-末端的激活结构域，通过与助激活剂p300的/ CBP与富含GC或CACCC启动子结合发挥作用。KLFs调节的一系列基因的表达，在许多生物过程中起关键作用(如：细胞增殖，分化中和干细胞重新编程)。目前，在人类中已鉴定17个KLFs成员。KLF4作(Krüppel-like factor 4，KLF4)为KLFs家族中的一员，既可结合到CACCC元件也可以结合到其它DNA序列来调节基因的表达。基本转录元件(basic transcription element，BTE)是KLF4的高亲和力结合位点，其往往在一系列高度保守的基因的启动子中发现。因为有转录激活和抑制的结构域，KLF4可以正负调节其下游靶基因，从而参与于肿瘤的发生发展。

1 上皮锌指蛋白4生物特性

1.1 上皮锌指蛋白4结构特点

人和鼠的KLF4的氨基酸长度分别是470和483，可以产生55kDa的蛋白质。KLF4能够大致分成3个区域：N端激活域、中心抑制区和C端DNA结合域。DNA结合域是由3个连续的锌指结构组成，每个锌指结构包含一个反向平行的β折叠、一个端环和一个α螺旋。β折叠上的2个半胱氨酸和α螺旋上的两个组蛋白共同整合一个锌离子，以起到稳定折叠的作用。每个锌指结构通过增加附加锌指结构从而增加锌指蛋白的序列特异性，与靶向DNA序列上的3个连续的氨基酸结合。

1.2上皮锌指蛋白4活化机制

KLF4的一个作用功能是激活靶基因的转录。KLF4的N末端含有一个强反式激活域，当直接融合到其3个C端锌指结构，这个强反式激活域就足以激活合成的报告基因。此外，其N端结构域能与转录活化因子前体转化酶p300/CBP相互作用，这种相互作用是转录的必需条件，当发生点突变阻止其与CBP交互作用，KLF4就不能激活转录。转录活化因子前体转化酶p300/CBP是组蛋白乙酰转移酶(Histoneacetyltransferase，HAT)蛋白，p300/CBP增多导致启动子组蛋白乙酰化的增加。组蛋白的乙酰化加速了其他转录因子和基本转录机制的招募。若KLF4在赖氨酸残基225和229处被p300/CBP乙酰化，这两个位点赖氨酸则突变为精氨酸，明显减弱了KLF4反式激活靶基因和抑制增殖的能力，这表明KLF4的乙酰化在其作用发挥中有重要意义。一项研究发现，KLF4不仅能与有内在组蛋白乙酰转移酶活性的双功能辅因子Tip60相互作用，还能招募组蛋白去乙酰化酶7(Histone deacetylase 7，HDAC7)，推测KLF4调节的反式激活机制也许是基因依赖性的。

1.3上皮锌指蛋白4抑制机制

转录因子的抑制机制包括主动抑制和被动抑制[1]。被动抑制就是与转录激活因子竞争，与靶基因序列结合而产生的抑制效应。在CYP1A1/HDC和SP1基因序列，KLF4结合一段序列，该序列与激活剂Sp1识别序列重叠，替换启动子上的Sp1，抑制靶基因。由于Sp1的表达无处不在并且积极调控许多基因，这也很有可能这就是KLF4抑制其多种靶基因的机制。主动抑制就是指KLF4能主动抑制一些基因的表达，或者而不是通过与转录激活因子竞争来被动的抑制。GAL4融合实验表明KLF4除了所熟悉的反式激活域，还有中心抑制区。KLF4通过招募并与HDAC1和HDAC2相互作用抑制CD11d，而KLF4通过招募HDAC3来抑制细胞周期素B1。在TP53基因，MUC1-C招募KLF4、HDAC1和HDAC3来调节抑制。KLF4通过直接竞争与p300结合的Smad3来抑制Smad3介导的PAI-1的活化。最后，KLF4通过与β-catenin/TCF4的直接相互作用，抑制Wnt信号通路的转录靶点。这些数据强有力的证明KLF4介导的活化和抑制是复杂且基因依赖性的。

1.4在细胞增殖中的作用

由于KLF4在已分化上皮细胞中作为抗增殖因子表达，KLF4通过减弱或增强抗增殖基因(如p21/wif1/cip1, p53和 E钙黏蛋白)和促增殖基因(如编码细胞周期素E1、细胞周期素D1、细胞周期素B1、鸟氨酸脱羧酶和胰岛素样生长因子结合蛋白2)转录来调控细胞增殖。KLF4能够直接独自或与其他蛋白结合来作用目的基因启动子的GC富含区域，从而改变特定基因的转录。KLF对细胞周期的调节起重要作用，过表达KLF4可使细胞停滞在G1/S期。细胞周期是由细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases，CDKs)所控制，CDKs的活性通过活化剂(细胞周期蛋白)和抑制剂(抑制因子)的控制。在癌细胞中，KLF4通过调节这些激酶、它们的活化因子和抑制因子作用癌细胞的细胞周期。KLF4的组成型表达反作用于主要的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子蛋白(p21，p27及P53)从而抑制DNA 的合成。

1.5 上皮锌指蛋白4在细胞分化的作用

除了在调节细胞增殖的作用，KLF4也对分化有着重要的调节作用。KLF4中高表达于表皮终末分化层。KLF4在结肠上皮细胞分化中起重要作用。在胃粘膜上皮细胞特异性的KLF4消融小鼠模型中， KLF4的转录谱已经表明，KLF4调节一系列上皮特异性的角蛋白的表达。此外，在食管鳞状上皮，KLF4转录上调分化的基因Epstein-Barr病毒的ED-L2和角蛋白4的表达，同时，在胰腺导管细胞，KLF4上调角蛋白19的表达。KLF4在分化中的作用已描述了很长时间，但最近的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)的研究已经确定KLF4作为4个转录因子中的一个，通过组合来使体细胞重新编程为iPS。此外，Leng等[2]人证明，在肿瘤干细胞中KLF4过表达仅在球体细胞，在体外和体内敲除肿瘤干细胞KLF4的表达，可显著减少癌干细胞标记物、耐化学品性、侵袭性、迁移性和肿瘤发生。这些研究揭示KLF4在调节分化与以往的研究存在争议，因此仍需要进一步的研究。

1.6 上皮锌指蛋白4参与干细胞的多潜能性

目前，许多研究表明KLF4参与肿瘤干细胞的调节[3]。KLF4可以维持正常干细胞和肿瘤干细胞的端粒酶活性，并在肝细胞长期增殖潜能中起着重要作用[4]。KLF4增强β-catenin的结合力，转录端粒酶的反转录转录酶，表明KLF4在干细胞和肿瘤发生之间的潜在关系[5]。在结肠肿瘤干细胞富集的球状细胞中，KLF4对维持肿瘤干细胞样特性起着重要作用，并在DLD-1细胞中起着致癌基因的作用促进结肠癌的发展[2]。此外，KLF4在乳腺癌肿瘤干细胞样细胞系中表达上调。体内实验证明：下调KLF4基因可抑制肿瘤的形成，过表达KLF4肿瘤干细胞数量增多[6]。因此，KLF4诱导肿瘤干细胞样特性可促进侵袭和转移。下调干细胞抑制性microRNAs可上调KLF4，可调控结肠癌和胰腺癌的肿瘤干细胞样特性。miR-7可抑制KLF4的表达，减少乳腺肿瘤干细胞样细胞的脑转移[7]。令人意外的是，KLF4与SOX2、OCT4以及MYC共同作用可将体壁细胞重塑成肿瘤干细胞样细胞[8]。最新研究进展表明P53突变可增强KLF4细胞重塑能力。上调变异体壁细胞或P53敲除的细胞内KLF4表达，可在小鼠体内产生侵袭性肿瘤[9]。

1.7 上皮锌指蛋白4参与上皮间质转化

近来发现KLF4在上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) 的过程中充当上皮基因的转录激活者和间充质基因的抑制剂[10]。在肝细胞癌中，外源性KLF4表达抑制间质特征，并改变细胞形态为上皮表型从而抑制细胞迁移和侵袭的活动、肿瘤生长和肺定植。敲除KLF4可增强间质特征和细胞迁移。研究表明KLF4能够结合并抑制slug启动子的活性，异位表达slug可部分恢复了KLF4介导的表型。关于KLF4在胃肠道癌症的EMT中的作用方面文献有限，但可对KLF4调控非胃肠道癌症EMT可能带来灵感。目前关于KLF4在EMT的转录调节作用主要集中在乳腺癌。在乳腺癌小鼠模型中，KLF4通过减少snail(EMT与转移的关键中介)的表达，来抑制EMT。

1.8 上皮锌指蛋白4参与体内稳态维持

结肠组织是由3种主要的分化细胞组成，肠细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞。活跃增值细胞位于隐窝的基底部并且在其分化过程中向腔面生长，最终脱落。KLF4能抑制扩增并促进分化，表现为KLF4在接近腔面高表达，向陷窝基底部表达逐渐降低。KLF4除了对肠道组织分化起重要作用，有更多的证据表明其外其他组织器官也同样发挥重要作用。例如，KLF4小鼠由于皮肤表皮屏障的缺陷很快死于脱水，反之，有针对性的过表达KLF4可以导致上皮渗透屏障的早期形成。KLF4的过表达能够协同增强母体注射型皮质醇加速皮肤屏障形成的作用。这种作用很可能是由于KLF4的目的基因和糖皮质激素受体的重叠。胎儿肺成熟过程中， KLF4可能协同增强糖皮质激素的作用促进胎肺发育。在发育的胚胎，KLF4与Sp1协同增强PSG-5的表达上调，PSG-5是一种通过胎盘分泌到母体中的蛋白。KLF4在前骨髓中的过表达增加了单核细胞标记物的表达，然而KLF4的低表达降低了这些标记物的TPA诱导过表达。KLF4在角膜上皮中高表达，其在角膜上皮的分化中起重要作用。定向删除眼内的KLF4会导致角膜脆性增加、角膜水肿及结膜杯状细胞减少。在脂肪细胞分化的细胞培养模型中，siRNA介导的KLF4表达的降低完全阻碍了已分化脂肪细胞数个表型标记物的表达。这些数据强有力的表明了KLF4参与了多种组织的分化过程。

2 在肿瘤中的作用

2.1 上皮锌指蛋白4作为肿瘤抑制因子

2.1.1胃肠肿瘤

目前，KLF4在胃肠肿瘤中研究最为广泛，KLF4在胃肠肿瘤中发挥肿瘤抑制作用[11]。KLF4是极少数的在胃肠道肿瘤发生开始表达下调的基因。由于过甲基化和杂合性的丢失，在肿瘤的形成和发展中，KLF4逐渐丧失表达。例如，在以往的研究中，胃癌从I期进展到IV期，KLF4的表达显著逐步丧失。此外，大多数人的胃癌细胞系同时出现KLF4在mRNA和蛋白水平表达降低。在结肠癌的发展，与结肠腺瘤邻近的正常黏膜相比，KLF4表达在结肠腺瘤显著下降。在结肠癌组织微阵列中分析：在癌组织与非癌症组织相比中，癌组织KLF4的表达显著降低或失去了表达，KLF4是生存的独立预测因子。此外，Choi等人(2006年)发现，KLF4表达在正常结肠黏膜表达，而且约1/4的结肠癌中KLF4表达缺失。在食管癌细胞系和组织中也发现KLF4的表达降低。除了这些临床证据，通过在RKO结肠癌细胞建立一个包含Klf4的的诱导型启动子的系统，Dang等人(2003年)证实，KLF4的过表达减少肿瘤细胞克隆形成、体内成瘤以及细胞迁移和侵袭。

2.1.2妇科肿瘤

在人宫颈癌，KLF4为肿瘤抑制因子发挥作用。Yang等[12]研究发现，KLF4在宫颈癌中通过抑制细胞增殖和肿瘤形成而作为一种肿瘤抑制因子，在宫颈癌中其功能处于失活状态。Yang等[13]发现，由于KLF4过甲基化，KLF4表达下调。通过亚硫酸氢钠测序检测正常宫颈组织和宫颈癌组织中KLF4启动子CpG岛的甲基化状态，RT-PCR,免疫组化，western-blot检测KLF4基因表达状态以及MTT分析宫颈癌细胞增殖状态。得出：在宫颈癌中，KLF4基因失活可能是甲基化诱导沉默机制，KLF4启动子高甲基化抑制其肿瘤抑制因子的功能。

在子宫内膜癌中，敲除致癌基因BMI-1可抑制体外子宫内膜癌细胞增殖和克隆增长，降低化疗抵抗类分子KLF4表达[14]。在子宫内膜癌细胞株HEC-1A中，过表达KLF9可诱导KLF4表达[15]。

在卵巢癌中，KLF4起着肿瘤抑制作用。Zohre等[15]研究发现：曲古抑菌素增强KLF4在SKOV3和A549细胞中的表达，KLF4可能通过增强细胞生长抑制、细胞凋亡发挥肿瘤抑制作用。Chen 等[16]证明通过抑制TGF-β诱导的上皮间质化转移而发挥卵巢肿瘤抑制作用。Yoon等[17]在进展性卵巢癌中，KLF4和Bcl2/Bax表达下调，其调控卵巢癌具体机制仍尚不清楚。

2.2 上皮锌指蛋白4作为癌基因

尽管KLF4在胃肠肿瘤，妇科肿瘤，肺癌，前列腺癌以及膀胱癌等恶性肿瘤中下调，但在皮肤鳞癌、喉鳞癌和70%乳腺癌中表达却上调。KLF4在乳腺癌中的作用机制目前存在很大争议[2]，有研究发现：与正常乳腺上皮细胞比较，乳腺癌细胞KLF4表达丢失，起着抑癌基因的作用。层黏连蛋白B5作为ECM蛋白核纤层蛋白α 的主要组成部分，KLF4可能通过下调层黏连蛋白B5发挥抑癌作用。尽管如此，也有研究发现KLF4在与乳腺癌细胞邻近的正常的乳腺上皮细胞中低表达，在肿瘤细胞中高表达。KLF4在肿瘤细胞中的高表达定位于乳腺浸润性导管癌的细胞核，并且核染色体增加预示着表型和预后更差。体外实验证明，KLF4在皮肤鳞癌表现为致癌基因。在小鼠皮肤基底细胞中强行表达可快速诱导增殖，异型增殖以及鳞癌样病变。

3展望

KLF4是一个复杂的转录因子。根据环境不同，它既可以作为转录激活剂，也可以作为转录抑制剂，既可以是癌基因，也可以是抑癌基因。KLF4在正常细胞、癌细胞和干细胞重组中发挥这些作用的机制仍不明确。证明抑癌基因和癌基因之间转换的分子基础仍需解决。

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[专业责任编辑：张忠明]

Research progress of KLF4 in tumor

LIU Hai-xia, SONG Hui, MA Rui, LI Na, ZHOU Fu-xing, CHEN Bi-liang

(Department of Gynecology and Obstetrics, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University, Shaanxi Xi’an 710032, China)

2015-09-21

国家自然科学基金资助项目(编号 ：81301921)；陕西省自然科学基金资助项目(编号：2013JM4023)。

刘海霞(1987-)，女，在读博士，主要从事妇科肿瘤研究。

陈必良，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.02.046

R733

A

1673-5293(2016)02-0282-03