牛支原体检测方法研究进展

庄金秋，张　颖，梅建国，刘吉山，姚春阳

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山 东滨州　256600）

牛支原体检测方法研究进展

庄金秋，张颖，梅建国，刘吉山，姚春阳

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山 东滨州256600）

随着规模化养牛业的不断发展，牛支原体已经成为危 害养牛业的一种重要致病性支原体。本文介绍了牛支原体病原学、血清学及分子生物学方面实验室检测方法的研究进展，为我国牛支原体病的防治提供了参考。

牛支原体；检测方法；病原学；血清学；分子生物学；研究进展

牛支原体（M. bovis）属支原体科支原体属，是一种介于细菌和病毒之间的无细胞壁的原核微生物。M. bovis可引起犊牛肺炎、乳腺炎、关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎，甚至流产与不孕等多种疾病。这些疾病常统称为牛支原体相关疾病（MbAD）。牛传染性胸膜肺炎（CBPP），简称牛肺疫，就是由与M. bovis同属的丝状支原体丝状亚种SC型（MmmSC）引起的烈性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报的动物疫病。MmmSC和M. bovis都是对牛致病力较强的支原体，可导致相似的临床症状和病理剖检变化，不易鉴别诊断。1961年，Hale［1］在美国首次从一例患乳腺炎的牛乳中分离出M. bovis；1976年，美国首次报道由M. bovis引起的肺炎；1983年，黎济申等［2］首次从我国患乳腺炎的牛乳中分离到该病原；2008年，辛九庆等［3］首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到该病原。M. bovis是危害犊牛健康的重要致病性病原体，具有较高的感染率和死亡率，即使是治疗后症状缓解的牛，一般都发育迟缓甚至成为废牛，严重影响了牛奶的产量和质量。近年来，MbAD已经在世界范围内广泛传播，且M. bovis可明显增加其他病原的继发感染，给世界养牛业造成了巨大的经济损失。牛支原体感染后无特殊症状，因此很难对该病进行感官判断，需借助实验室诊断确诊。本文综述了近年来M. bovis感染的最新实验室检测方法研究进展，以期对该病的预防和控制提供参考。

1　牛支原体分离鉴定

支原体分离鉴定方法应严格按照无菌操作规程，将患病动物的组织病料接种于培养基中。支原体培养的营养需求较高，通常要在培养基中加入10%～20%马血清，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养3～5 d。在类胸膜肺炎微生物（PPLO）固体培养基中进行分离培养时，在光学显微镜下，菌落呈现典型的“煎蛋状”、边缘整齐、表面光滑、中间厚周边薄的菌膜斑点。如若7 d未发现生长迹象，可判断为阴性。初步鉴定后，在含酚红的液体培养基中培养，观察培养基颜色是否由红变黄，且稍浑浊，之后根据配套的生化反应进行鉴定。鉴定为支原体后，需应用聚合酶链式反应（PCR）等方法来鉴别诊断是否为M. bovis或者其他支原体。常用的液体培养基包括Hayfi ick、Edward、Frey、MEM-KMZ、SP-4等。M. bovis对外界环境要求较高，采集的病料如未能及时送往实验室，极易导致病原死亡。一般病料需冷藏运输，运输时间不要超24 h，也可将其冻存于运输培养基中进行运输。对于病料的采集，一般在下呼吸道比上呼吸道分离出病原的概率大。虽然牛支原体分离鉴定可以确诊是否有M. bovis的感染，但是分离难度大，分离周期长，不能作为快速诊断M. bovis感染的有效方法来使用。

2　血清学方法

血清学方法是检测M.bovis感染的可靠方法，尤其对于经抗生素治疗或慢性的病例。血清抗体检测方法比病原培养方法更敏感，包括酶联免疫吸附试验、间接血凝试验、胶体金免疫层析试纸条和免疫组化技术等。

2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

利用全菌抗原或重组抗原建立的间接ELISA方法是检测血清抗体的首选方法，应用最为广泛。用处理过的M.bovis全菌蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法，不仅能够检测血清抗体，还可以检测患有乳腺炎奶牛的乳清抗体，被广泛应用于M.bovis感染的流行病学调查。但是由于建立该方法的抗原为全菌蛋白，其特异性有待提高。鉴于此，研究者先后建立了以M.bovis的VSP重组蛋白和膜脂蛋白P48作为包被抗原的间接ELISA方法，用以检测对应抗体。2014年，F u等［4］利用P48重组蛋白作为包被抗原，其相应的单克隆抗体用HRP进行标记，建立了直接竞争ELISA方法检测M.bovis抗体。以P48蛋白作为包被抗原的ELISA方法能检测M.bovis的所有分离株，且不与感染牛的其他六种支原体反应，对于检测M.bovis感染有很好的应用前景。2014年，Wawegama等［5］鉴别出一种可以具有脂肪酶活性的膜蛋白（MilA）。该蛋白氨基末端与M. bovis抗体有很强的免疫反应。利用大肠杆菌诱导表达的该段蛋白建立了间接ELISA方法，其敏感性达到92.86%，特异性高达98.7%。2014—201 5年，金云云等［6］、Han等［7］以M.bovis全菌蛋白作为包被用抗原，建立了检测M.bovis血清抗体的间接ELISA方法。该方法可以区分出感染牛和免疫牛，从而可以判断牛感染程度高低以及疫苗是否有效。国外商品化检测M. bovis抗体的ELISA试剂盒有瑞士、加拿大和比 利时等国家研制的试剂盒。2011年，刘洋等［8］将纯化后的P28重组蛋白作为抗原建立了检测M.bovis血清抗体的间接ELISA方法，并组装成试剂盒，填补了国内ELISA试剂盒的空白。该试剂盒具有良好的敏感性、特异性和稳定性，能在一次反应中对M.bovis和MmmSC作出鉴别诊断，与加拿大商品化试剂盒Kit 1的检测结果符合率高达92%，各种技术指标相当，可作为进口试剂盒的替代品，用于M.bovis的临床诊断与流行病学调查。

2.2 间接血凝试验（IHA）

IHA是一种经典的免疫学诊断技术，因具有操作简单、稳定、成本低、敏感性和特异性较高，且对试验条件要求低等优点，被广泛应用于兽医实验室检测、田间血清学调查和基层兽医部门的辅助诊断。2015年，简莹娜等［9］以纯化的P48重组蛋白致敏醛化-鞣酸化的绵羊红细胞并对其工艺进行优化，建立了检测M. bovis抗体的IHA方法。该方法与国外商品化的ELISA试剂盒比较，平均符合率为96.15%。对833份田间血清和1 084份乳清进行检测，阳性率分别是15.37%和19.56%。该方法敏感性高、特异性强重复性好，可用于M. bovis抗体水平监测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学调查。

2.3 胶体金免疫层析试纸条

2015年，简莹娜［10］利用牛支原体P48重组蛋白，建立了检测M. bovis抗体的胶体金免疫层析试纸条。应用该试纸条检测临床血清200份和乳清108份，阳性率分别是21.50%和17.59%，与IHA方法相比符合率为96.53%，表明该试纸条敏感、特异、快速，适合于M. bovis抗体的快速检测。

2.4 免疫组化技术

免疫组化技术是一门将免疫学与组织化学相结合的技术，在组织细胞原位通过抗原-抗体特异性结合反应和组织化学显色反应，借助可见的标记物对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测，不仅能准确判断是否有病原感染，而且能清晰反映病原在组织器官和细胞中的定位及分布。该方法操作简便、不需要专门的仪器设备，适合于基层临床的快速诊断，并且对于研究病原在机体内的致病机制及分布规律也有一定的辅助作用。1995年，Adegboye等基于单克隆抗体建立了免疫组化方法，检测犊牛肺组织中的M.bovis。2001年，Haines等建立的免疫组化技术，对牛场M.bovis感染所致的急、慢性呼吸道疾病、肺炎、乳腺炎等进行了病原体检测。2004年，Khodakaram-Tafti等采用免疫组化方法进行M.bovis的诊断，不仅能对福尔马林固定的组织进行M.bovis检测，还能清楚地显示出M.bovis在病灶内的具体位置，直观地观察病变组织的病理变化以及M.bovis侵袭机体后的分布情况。2013年，金云云等［11］以鸡抗M.bovis IgY为一抗，以HRP标记的羊抗鸡IgG为二抗，建立了检测M.bovis的间接免疫组化法。该方法可用于检测临床病例组织样本及培养物中的M.bovis，为探究该病原在机体内的定位、动态分布规律及致病机理提供了手段。

2.5 其他血清学方法

如应用兔源高免疫血清鉴定M.bovis的抗体检测方法，其包括生长抑制试验（GI）、生物膜形成抑制试验（FI）、荧光抗体试验（FA）和新陈代谢抑制试验（MI）等。由于这些试验无商品化抗血清，需在实验室自行制备，因此操作时较为费时费力。

3　分子生物学方法

由于牛在养殖场环境中停留2～4周后都存在可检测滴度的M.bovis抗体，所以血清学检测方法无法准确诊断牛肺炎病例是否由M.bovis引起。分子生物学方法相对快捷方便，而且灵敏度高，已被广泛应用于M.bovis的实验室检测。分子生物学方法包括PCR技术、荧光定量PCR技术、环介导等温扩增技术（LAMP）和双向电泳技术等。

3.1 PCR技术

早期国外研究者利用PCR方法扩增16S rRNA用来检测M. bovis的感染，但是由于其与无乳支原体（M. agalactiae）的16S rRNA同源性高达99.8%，在不结合其他方法的情况下无法区分这两种病原的感染。于是研究者又通过16S rRNA的PCR和酶切系统来鉴别这两种支原体。后 来，研究者先后选取DNA修复基因uvrC、ATP结合蛋白oppD/F基因、p81基因作为靶基因进行特异性扩增，应用于临床患病牛的病原学检测，并对M.bovis和M. agalactiae作鉴别诊断。我国自2008年开始对M. bovis进行深入研究，p81蛋白是M.bovis和M. agalactiae共有的蛋白，但两者的同源性仅为67%。2009年，李媛等［12］根据P81基因引物建立了PCR方法，可以从人工感染牛的鼻拭子和临床发病牛肺中扩增出目的片段，与分离培养结果完全符合，为国内首次建立的敏感、特异、快速的牛支原体PCR检测方法。同年李媛等利用oppD/F为靶基因设计引物，建立了套式PCR方法，成功鉴别了M.bovis和M. agalactiae。2009年，李彦芹［13］利用通用引物扩增16S rRNA建立了能够快速鉴别诊断MmmSC、M.bovis、M. agalactiae和绵羊肺炎支原体的多重PCR方法。2010年，刘洋等［14］建立了可以同时鉴别检测M.bovis和MmmSC的双重PCR方法。2011年，李大伟等［15］建立了一种可一次性区分上述三种支原体的三重PCR方法，用于临床诊断和流行病学调查。2015年，胡国明［16］根据牛支原体P48基因设计引物，建立了M.bovis与M. agalactiae、MmmSC、滑液支原体、鸡毒支原体等病原的PCR鉴别诊断方法，具有很高的特异性和敏感性，对M.bovis感染的临床快速、准确的诊断具有较高的实用价值。

3.2 荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术也被用于M.bovis检测的研究。2005年，Cai等应用杂交探针和退火温度建立了扩增16S rRNA基因序列的实时定量PCR方法，用以检测奶牛乳以及肺组织中的M.bovis，在检测牛乳时其敏感性达100%，检测肺组织时其敏感性达96.6%。2000年，Sachse等针对OppD基因，设计了实时定量PCR引物及探针，在患乳腺炎及呼吸道疾病的病牛中，能够灵敏特异地鉴别出M.bovis，检测限能够达到100 cfu/mL。2010年，Rossetti等根据uvrC基因设计引物，建立了实时定量PCR方法。该方法不需要处理牛乳及组织样品获取纯化的DNA，可直接用于实时定量PCR检测，具有良好的特异性高度敏感性，方便用于M.bovis的检测。

3.3 环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点，适于基层实验室的监测。2005年，Saito等利用LAMP方法对肺炎支原体进行检测，相同时间内LAMP检测法的灵敏度远高于实时定量PCR法，在对70例患者及25例正常人咽试纸检测中的阳性率为100%，无假阳性。2012年，Churchward等同时用竞争性ELISA、套式PCR及LAMP对丝状支原体进行诊断，结果显示LAMP法的敏感性远高于竞争性ELISA和套式PCR。2011—2012年，白智迪［17］、侯轩等［18］先后根据M.bovis的uvrC基因设计引物，建立了LAMP方法，其敏感性较PCR方法高100倍。在对167个临床鼻拭子样本的检测中，LAMP方法检测结果的阳性率（26.95%）高于PCR检测阳性率（19.16%）。2014年，金云云等［19］根据P81基因设计引物建立了LAMP方法，其最低检出限为1.1 ng/L。LAMP方法方便快速，成本低廉，可被大范围推广使用。

3.4 双向电泳技术

2012年，陈维等［20］成功建立了M.bovis蛋白质组学双向电泳技术。由于国际上目前尚无M.bovis蛋白组学的相关报道，所以该方法可以鉴定出相应的致病性蛋白，为M.bovis致病机理的研究提供蛋白质组信息。

4　小结

随着养牛业的不断发展，牛支原体病的流行范围越来越广，发生频率也越来越高，严重威胁了我国养牛业的发展。我国对于本病的研究起步较晚，国内外对该病原的研究不透彻，特别是对牛支原体疫苗及其遗传稳定性的研究资料非常缺乏，国际上也尚无公认的特异性诊断方法，对于该病致病机制的研究尚未达成共识，从而给该病的预防控制带来了不便。因此，建立快速、准确的检测方法，开发新型疫苗等防控产品，具有十分重要的意义。上述各种检测方法各有优点和实用性，实际中需根据不同的场合、条件等选择使用其中的一种或者多种方法。随着人们对M.bovis的深入研究，相信该病的检测方法将不断得到改进，更加简便化、快速化和准确化。

［1］ Hale H H，Helmboldt C F，Plastridge W N，et al. Bovine mastitis caused by Mycoplasma species［J］. Cornell Veterinarian，1962（52）：582-591.

［2］ 黎济申. 牛的霉形体性乳房炎［J］. 上海畜牧兽医通讯，1983（4）：46.

［3］ 辛九庆，李媛，郭丹，等. 国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体［J］. 中国预防兽医学报，2008，30（9）：661-664.

［4］ Fu P，Sun Z，Zhang Y，et al. Development of a direct competitive ELISA for the detection of Mycoplasma bovis infection based on a monoclonal antibody of P48 protein［J］. BMC veterinary research，2014（10）：42.

［5］ Wawegama N K，Browning G F，Kanci A，et al. Development of a recombinant protein-based enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of Mycoplasma bovis infection in cattle［J］. Clinical and Vaccine Immunology，2014，21（2）：196-202.

［6］ 金云云，剡根强，王静梅，等. 牛支原体间接ELISA检测方法的建立［J］. 畜牧与兽医，2014，46（2）：10-14.

［7］ Han X X，Khan F A，Zhu X F，et al. Establishment of an antibody avidity test to differentiate vaccinated cattle from those naturally infected with Mycoplasma bovis［J］. Veterinary Journal，2015，203（1）：79-84.

［8］ 刘洋，陈维，宋志强，等. 3种ELISA试剂盒检测抗牛支原体抗体的比较［J］. 中国预防兽医学报，2011，33（6）：448-451.

［9］ 简莹娜，储岳峰，赵萍，等. 牛支原体P48蛋白的表达及间接血凝检测方法的建立与应用［J］. 中国兽医科学，2015，45（3）：241-246.

［10］ 简莹娜. 基于P48重组蛋白的牛支原体抗体检测技术研究［D］. 北京：中国农业科学院，2015.

［11］ 金云云，剡根强，王静梅，等. 牛支原体间接免疫酶标组织化学检测方法的建立［J］. 中国畜牧兽医，2013，40（5）：26-30.

［12］ 李媛，董惠，张美晶，等. 牛支原体套式PCR检测方法的建立［J］. 中国畜牧兽医学报，2009，31（9）：709-711.［13］ 李彦芹. 牛支原体PCR检测方法的建立及临床应用［D］.泰安：山东农业大学，2009.

［14］ 刘洋，李媛，董惠，等. 牛支原体双重PCR检测方法的建立［J］. 中国预防兽医学报，2010，32（8）：599-602.

［15］ 李大伟，黄灿平，张彦明，等. 牛支原体、无乳支原体和丝状支原体丝状亚种小克隆三重PCR检测方法的建立及初步应用［J］. 畜牧兽医学报，2011，42（2）：306-310.

［16］ 胡国明. 基于脂蛋白P48的牛支原体快速检测方法的建立［D］. 兰州：甘肃农业大学，2015.

［17］ 白智迪. 牛支原体LAMP检测方法的建立及体外传代致弱菌株的特性鉴定［D］. 武汉：华中农业大学，2011.

［18］ 侯轩，付萍，张海燕，等. 牛支原体的环介导等温扩增快速检测技术研究［J］. 农业生物技术学报，2012，20（2）：218-224.

［19］ 金云云，王静梅，剡根强. 基于牛支原体P81基因环介导等温扩增方法的建立及应用［J］. 中国兽医学报，2014，34（4）：571-577.

［20］ 陈维，李媛，辛九庆，等. 牛支原体蛋白质组学双向电泳技术的建立及初步分析［J］. 东北农业大学学报，2012（3）：42-47.

（责任编辑：杜宪）

Research Progress on Detection Methods of Mycoplasma Bovis

Zhuang Jinqiu，Zhang Ying，Mei Jianguo，Liu Jishan，Yao Chunyang
（Binzhou Animal Husbandry and Veterinary Academy，Binzhou，Shandong 256600）

With the development of the large scale cattle industry，Mycoplasma bovis has been becoming one of the most important pathogenic Mycoplasma species causing serious damage. In order to offer reference for its prevention and control in our country，the research progress of laboratory detection methods for Mycoplasma bovis was introduced，which included etiology，serology and molecular biology.

Mycoplasma bovis；detection method；etiology；serology；molecular biology；research progress

S852.65

A

1005-944X（2016）11-0066-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.019

山东省现代农业产业技术体系牛产业创新团队项目（SDAIT-09-12）；山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）