SSR标记在中药材分子身份证体系构建中的应用△

周骏辉，袁媛，黄璐琦

(道地药材国家重点实验室培育基地 中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700)

·专论·

SSR标记在中药材分子身份证体系构建中的应用△

周骏辉，袁媛*，黄璐琦

(道地药材国家重点实验室培育基地 中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700)

简单重复序列(SSR，simple sequence repeat)是真核基因组上一段短的重复序列，具有分布广泛和保守性较高的特点，常用于遗传多样性分析和物种鉴定。针对现有鉴定方法难以完成药材近缘种及种下水平基原鉴定，以及栽培产区扩大导致急需建立中药材种质和农家种鉴定方法的需求，本文简要介绍了SSR的概念和筛选方法，及其在中药材分子身份证体系构建中的应用，旨在为中药鉴定和质量评价体系建设提供参考。

SSR分子标记；中药材；遗传多样性；品种鉴定

中药作为我国传统医学的重要部分，已有上千年的历史。作为中药产业的源头，药材质量对中药可持续发展具有重要意义。药材真伪鉴定是中药质量评价的关键内容之一，已有的研究往往仅侧重于药材基原种间水平的鉴别。然而中药材品种繁多、产地广泛，同种药材在种下水平上也存在遗传变异，如不同产地的绿杆天麻，其酯酶同工酶谱也不尽相同[1]。并且在长期的栽培过程中形成了丰富的种质资源和农家品种，不同种质资源和农家品种在化学成分和药理活性上也可能存在差异。田伟等[2]对山东丹参种质资源进行调查，结果显示，10个种质的产量和丹参酮的含量差异明显，这将对药材的质量和临床疗效造成影响。

传统鉴别技术主要是通过眼看、手摸、鼻闻、口尝、水试、火试等方法对中药材的药用部分进行鉴别[3]。然而对于那些亲缘关系较近的正品及其混淆品，尤其是种下水平的基原鉴定，传统方法就显得力不从心。通过色谱、波谱等理化鉴定方法对中药材的活性成分进行检测可以对药材的质量进行评价[4]，但活性成分的含量会受到采收时期、产地、栽培方式、加工方式等多种因素的影响。

DNA分子标记技术在中药鉴定中具有独特的优势：一方面，由于生命体基因组变异十分丰富，从而使药用植物DNA的分子标记也十分丰富；另一方面，DNA分子标记可以对中药材不同发育时期、不同组织器官进行检测，且不受环境和基因表达的影响。近年来，DNA分子标记技术已被应用于中药资源、中药鉴定、药材品质形成及质量评价等研究。如利用DNA分子标记技术对栀子进行种质筛选，为优良品种选育打下基础[5]；对当归进行遗传多样性分析，为种质资源收集保存提供理论依据[6]；在天南星及其混伪品鉴别中，DNA分子标记技术也发挥着重要作用[7]。

目前基于聚合酶链式反应(PCR)的分子标记技术主要包括RAPD(random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA标记)、AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)和SSR(simple sequence repeat，简单重复序列)等。在这些类型的分子标记中，SSR分子标记只需要检测少量DNA样品，并且条带简单一致。SSR序列还具有较高的多态性、共显性、含量丰富的特点[8]，非常适合作为分子标记用于中药材的鉴定工作。

本文主要介绍了SSR的基本原理及分布特点，并对近年来SSR标记在药用植物研究中取得的成果进行总结和分析，为其在中药鉴定中的进一步应用提供参考。

1 SSR分子标记概念

SSR是存在于真核生物基因组非编码区的一段简单重复序列，在物种进化过程中呈现较为保守的特性，因此常用于DNA指纹图谱的构建和物种鉴别。SSR序列也被称为微卫星序列(microsatellites)[9]和短串联重复序列(short tandem repeat，STR)，通常由2～6个重复的核苷酸构成[10]。

SSR最早在人类基因组的研究中被提出，随后在其他真核生物中，如哺乳动物、鸟类、鱼类、酵母和植物中均有报道[11]。在植物基因组中，每隔21～65 kb就会出现一个SSR位点[12]，且不同基因型中SSR序列的核苷酸重复数目也不尽相同。由于SSR具有这种分布广泛、含量丰富、种类繁多的特点，其作为分子标记在物种多态性分析方面具有重要应用价值。尤其是SSR呈现出的DNA多态性，能够对亲缘关系较近的物种进行区分，弥补了传统鉴别方法在近缘物种鉴别中的不足。

2 SSR分子标记的获取

SSR分子标记主要是从基因组序列、转录组序列和EST序列(expressed sequence tag，表达序列标签)中获得。随着高通量测序技术的不断发展，全基因组测序的成本不断降低，产生了大量的中药材基因序列[13]，这些数据便是SSR分子标记的重要来源。SSR通常长度为100～200 bp，并且其两端序列相对保守，可以由这些保守序列设计特异性引物。目前常用的SSR筛选软件有SSRHunter、MISA和ssr.pl(http：//www.gramene.org/db/markers/ssrtool)等。

从基因组序列中已获得了灵芝[14]、黄芩[15]、丹参[16]等中药材的SSR分子标记，但是大部分药用植物的基因数据仍未公布。由于SSR序列在物种进化过程中是相对保守的，即SSR侧翼序列在属内种间或有较近亲缘关系的属间有一定的保守性，甚至有部分SSR位点在亲缘关系较远的分类群中也具有保守性[17]，因此，也可利用近缘物种的基因数据获取SSR序列。如在豆科植物黄芪的研究中，因为黄芪自身的基因信息非常有限，所以很难采用黄芪基因组序列设计相关SSR引物，利用已报道的大豆引物也可成功扩增出黄芪的SSR序列[18]。

与基因组序列相似，转录组序列也能作为SSR分子标记的来源[19]，其更多地体现出基因编码区域的信息，可以更直接地用于基因表达及其药材性状相关的研究。且转录组测序的成本更低、所包含的信息更多，在中药资源和中药鉴定研究中将发挥重要的作用。

EST(expressed sequence tag，表达序列标签)是通过对cDNA文库克隆进行大规模测序所获得的5’或3’端序列，长度一般为 300～500 bp，可代表生物体某一时间内某组织中表达的基因。以EST数据库为基础构建SSR标记，即EST-SSR，是目前较为流行的方法。EST-SSR具有很好的保守性，在不同物种间的通用性较好。在NCBI数据库中收录了药用植物的大量EST序列，可用于EST-SSR的开发，降低了EST-SSR的开发成本和时间。尽管EST数据库可以为SSR标记提供大量来源，但能够用于引物设计的EST数目却相对较低[20]。这是因为EST序列长度普遍小于1000 bp，而在这有限的长度内，含有重复序列的EST只有很少一部分，并且在筛选引物过程中还会排除一定数量的EST序列，这就导致了EST数据库在进行SSR构建时的利用率较低。如NCBI上有10 260条球孢虫草EST序列，但是最终能够用于构建SSR分子标记的只有718条序列[21]。

3 遗传多样性分析

遗传多样性分析结果是构建中药材DNA指纹图谱及其DNA身份证的基础。由于SSR序列表现出较高的多态性和共显性，并且符合孟德尔遗传定律，使得SSR分子标记非常适合亲缘关系较近物种间遗传多样性和遗传变异的比较[22]。

中药材种质或农家品种的遗传多样性往往与其本身的特性相关，不同种质或农家种间的SSR序列会存在差异。如采集自同一生境下的野生居群鱼腥草，利用SSR分子标记分析结果表明，其单株样本间同样存在遗传变异[23]。

筛选适合的SSR标记组合，首先需要进行中药材种质或农家品种的遗传多样性分析。如利用SSR标记对不同产区三七种质进行遗传多样性分析，在此基础上筛选合适的标记，将易感病类型以及遗传一致度较低的品种进行区分，从而为三七选种和纯化提出依据[24]。

4 DNA指纹图谱与分子身份证

随着中药材栽培产区的不断扩大，同一种质在不同产区出现了性状特征发生改变的现象，这可能导致新种质的出现；另一方面，在引种的过程中也出现了盲目引种的情况，加剧了种质混乱，难以从源头上保证药材的产量和质量。

分子身份证是在指纹图谱的基础上发展起来的一种新的电泳图谱，与指纹图谱的区别在于分子身份证把品种特征数字化后，采用资源特征分析软件分析得出字符串形式的结果，这种结果可以简单明确地区分品种间的差异[25]。分子身份证既能够鉴别生物个体之间的差异，又能对生物个体的特征进行鉴定，易于存档记录和分析比较。分子身份证已被广泛应用于农作物和果蔬的种质研究中，而在中药材领域还处于刚刚起步的阶段。

利用SSR分子标记构建DNA指纹图谱可以有效区分表型特征相似的近缘物种、种质资源以及农家种。即依据SSR序列多态性信息，采用不同SSR序列组合，建立每种药材及其种质或农家种的DNA指纹图谱，构建中药材分子身份证体系。如利用3对SSR引物即可区分出忍冬、红白忍冬和4种山银花[26-27]；仅用两对SSR引物就能够鉴别出恩施产区的厚朴和其他湖北省产地的厚朴[28]。将这些SSR引物的扩增结果转化为数字信息，即构建了中药材分子身份证。如在大豆抗性基因相关的SSR标记的研究中，一个大豆品系的分子身份证为3434142，其含义为第一条SSR引物扩增出来的带型为3，第二条SSR引物扩增出来的带型为4，以此类推[25]。由于SSR分子标记的多态性和特异性，每个物种的分子身份证也是独一无二的。这种数字化的种质信息不仅利于保存，更能简单而准确地鉴别种质差异。本课题组筛选获得一套金银花引物，可同时区分不同产地的5份金银花种质，构建了金银花分子身份证体系[29]。

5 小结

中药材是我国独特且具有战略意义的宝贵资源，在2015年颁发的《中药材保护和发展规划(2015～2020年)》中表明，中药资源是战略资源，其种植和保护都是至关重要的。随着中药工业产值的激增，中药材种质资源的保存和管理，以及药材质量控制都需要明确且有效的方法和标准。SSR分子标记已在物种鉴定、遗传多样性分析等方面发挥了重要作用，将其应用到中药材物种、种质资源以及农家种鉴定，建立标准数据库和分子身份证体系，不仅有利于中药材质量控制，还在中药材种质资源保护、评价与利用以及中药材新品种选育等领域均发挥重要的推动作用。

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ApplicationofSSRMarkersinEstablishmentofMolecularIdentityforTraditionalChineseMedicinalMaterials

ZHOU Junhui，YUAN Yuan*，HUANG Luqi

(StateKeyLaboratoryofDao-diHerbs，NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica，ChineseAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

SSR (simple sequence repeat) is eukaryotic DNA sequence that consists of repeat motifs.Because of its wide distribution and high conservation，SSR markers have been widely used in studying genetic diversity and genetic relationships.The existing identification methods are incompetent for differentiating closely related species or infra-species of traditional Chinese medicinal materials.Because of the increasing of traditional Chinese medicinal materials production areas，a more efficient identification method is needed.This review provides brief information on mapping and application of SSR markers，and can be a reference for identifying traditional Chinese medicinal materials.

SSR markers；traditional Chinese medicinal materials；genetic diversity；variety identification

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.001

2015-11-06)

中医药行业科研专项(20140703)；科技基础性工作专项(2015FY111500)

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袁媛，研究员，研究方向：分子生物学；Tel(010)6401441-2847，E-mail：y_yuan0732@163.com