视网膜血管铺片技术的改进

徐玉环，徐艳峰，刘　颖，黄　澜，李彦红，韩云林，邓　巍，

许庆刚2，秦　川1，朱　华1

(1. 中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，

国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京　100021;

2. 首都医科大学附属北京同仁医院,北京　100730)



视网膜血管铺片技术的改进

徐玉环1，徐艳峰1，刘颖1，黄澜1，李彦红1，韩云林1，邓巍1，

许庆刚2，秦川1，朱华1

(1. 中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，

国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京100021;

2. 首都医科大学附属北京同仁医院,北京100730)

【摘要】目的探讨视网膜血管铺片技术的改进及在实验动物小鼠，大鼠，狗和猴中的应用。 方法 应用蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片，行HE及PAS染色观察血管形态，免疫组化方法观察CD31及VEGF的表达。结果用改进方法制备的视网膜血管铺片，血管网完整，无神经组织残留，可清晰显示血管走向。各级血管形态清晰，血管分支清楚完整，无断裂现象。血管内皮细胞形态清晰。CD31在血管周细胞及内皮细胞均有表达；VEGF主要在内皮细胞表达。结论改进的视网膜血管铺片技术可成功应用于不同实验动物，为视网膜血管性疾病的研究提供了重要途径。

【关键词】视网膜血管铺片; 联合消化法; 抗原修复

视网膜是由大脑向外延伸的视觉神经末梢组织，其结构复杂、精细、脆弱而代谢旺盛。其血管属于终末血管系统，任何病理性的破坏和血管梗阻等引起的组织缺氧，均能导致组织坏死，使其丧失感受和传导光刺激的功能。因此血管改变是视网膜病变的重要特点。视网膜血管铺片是研究视网膜血管病变的重要技术。但这项技术的消化时间不宜掌握，展片难度大，很难制备出理想的视网膜血管铺片。国内外学者多采用胰蛋白酶直接消化或胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化制备视网膜血管铺片。在本研究中，我们总结前人经验，不断摸索改进，建立了新的视网膜血管铺片技术，现总结如下。

1材料和方法

1.1材料

BALB/c小鼠来源于军事医学科学院实验动物中心【SCXK(军)2012-0004】，SD大鼠购自中国食品药品检定研究院实验动物资源研究中心【SCXK(京)2012-0001】，SYXK(京)2013-0019。犬购自北京日新科技有限公司【SCXK(京)2011-0007】，恒河猴由中国医学科学院医学实验动物研究所提供【SCXK(京)2014-0011】，SYXK(京)2010-0030。苏木素及伊红Y染色液均为国产试剂(益利精细)，高碘酸(批号011108，北京)，Schiff(UFG0108，上海)， Proteinase K (CALBIOCHEM, cat#539480)，Trypsin 1:250 Porcine Pancreas(AMRESCO, lot#2861C173), anti-CD31 antibody(ABCAM, ab28364), anti-VEGF antibody(BOSTER，cat#BA0407), 兔超敏二步法免疫组化检测试剂 (中杉金桥，PV-9001)。正常羊血清工作液(中杉金桥，ZLI-9056)，抗体稀释液(中杉金桥，ZLI-9030)。

1.2方法

1.2.1大鼠视网膜血管铺片的制备

大鼠脱颈椎法处死，摘取眼球，固定于10%中性福尔马林。

沿距齿缘剪开眼球去除晶状体，用蒸馏水漂洗，以视神经乳头为中心将眼球壁均匀地剪成4份，剥离眼球壁视网膜层，再用蒸馏水漂洗。

将剥离出的视网膜放在蒸馏水中37℃孵育1～2 h，蒸馏水漂洗，孵育后的视网膜放入1 g/L的蛋白酶K中，56℃消化13～17min，去除消化掉的感光层细胞，蒸馏水漂洗，再将视网膜层放入3%胰蛋白酶消化液中，37℃消化40～60 min。

用吸管将半透明状的血管网移入蒸馏水中漂洗，用吸管轻轻吹打非透明状区域，直到血管网成透明状, 再将吹打成透明状的血管网铺到含多聚赖氨酸的载玻片上，展平，自然干燥。

在消化过程中，蛋白酶k消化时，每5 min轻柔摇动一次，再以最低完成消化时间为观察起点：蛋白酶K消化13 min时，肉眼观察，轻柔摇动，若见感光层细胞脱落，即完成第一步消化。若消化不完全，每2 min轻柔摇动观察一次，直至感光层脱落。胰蛋白酶消化时，每10 min轻柔摇动一次，也是以最低完成消化时间为观察起点，若消化不完全，每5min轻柔摇动观察一次。

1.2.2不同动物的视网膜在消化酶中的消化时间

在大鼠铺片基础上，我们摸索了BALB/c小鼠，犬和恒河猴视网膜血管铺片的消化时间表1。BALB/c小鼠眼球小，在剥取视网膜层之前，要将眼球壁均匀剪成2份。犬和恒河猴眼球较大，结构特殊，取材后需立即固定4h，再用锋利的刀片在眼球的上下部各切开一个小口，继续固定24h。将眼球壁均匀地剪成若干等份，每一等份大小约0.4 cm×0.4 cm，再剥离视网膜层。

表1　不同动物的视网膜在消化酶中的消化时间

1.2.3视网膜血管铺片HE染色

将视网膜血管铺片置于自来水中水化15 min，苏木苏染核1 min，自来水冲洗，伊红复染2 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.4视网膜血管铺片PAS染色

PAS染色方法参照文献[1]：将视网膜血管铺片置于自来水中水化15 min，蒸馏水洗2次，加入高碘酸氧化10 min，蒸馏水速洗2次，加入schiff试剂反应5 min，自来水流水冲洗2 min，苏木素染核2 min，自来水返蓝5 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.2.5视网膜血管铺片免疫组化染色

免疫组化染色方法参照文献[2]，略有改变：①将视网膜血管铺片置于PBS中水化15 min；②微波中火修复5 min；③3%双氧水封闭15 min；④正常羊血清工作液封闭20 min；⑤滴加用抗体稀释液稀释的一抗(CD31稀释度为1∶50；VEGF稀释度为1∶200)，室温孵育1.5 h；⑥滴加二抗试剂1，室温孵育10 min；⑦滴加二抗试剂2，室温孵育10 min； ⑧ DAB显色；⑨苏木素复染4 s;⑩梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片

2结果

2.1大鼠视网膜血管铺片

经HE及PAS染色可见：铺片完整，清晰显示血管走向。各级血管形态清晰，血管分支清楚完整，无断裂现象。细胞形态清晰，细胞核可清晰显示(彩插12图1)。

酶消化会造成部分抗原的丢失，因此需要对抗原进行修复。修复温度太低造成修复不完全，温度太高又会脱片。经过摸索，我们发现，微波中火5min即可将抗原修复。免疫组化结果显示：CD31和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在正常大鼠铺片均有表达：CD31在血管周细胞及内皮细胞均有表达；VEGF主要在内皮细胞表达。

2.2小鼠、狗、猴视网膜铺片

根据大鼠铺片经验，我们摸索了BALB/c小鼠，犬和恒河猴的视网膜血管铺片消化时间。经HE及PAS染色，可见血管网完整，无神经组织残留。各级血管结构清楚，大动物小动脉可显示血管壁的平滑肌。毛细血管网由内皮细胞和周细胞组成，细胞形态清晰，细胞核结构清楚(彩插12图2)。

3讨论

1960年Kuwabara[3]用胰蛋白酶对视网膜进行消化制备了视网膜血管铺片，为视网膜血管的研究提供了一种新的手段。1963年Ashton[4]改进了Kuwabara的方法，用胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法，成功制备了猫的视网膜血管铺片。此后又经过各国学者的不断努力[5-8]，才有了今天的技术基础。

视网膜血管消化铺片技术难度较大：消化不完全，铺片不能充分显示出血管。消化过度，又会造成血管结构不清晰，甚至断裂，直接影响对实验结果的观察和分析。蛋白酶K是一种高活性蛋白酶，能快速、有效地裂解组织细胞，因此在本研究中，我们选择先用蛋白酶K消化掉视网膜感光层细胞。同时，蛋白酶K能穿透细胞膜，破坏细胞核，于是我们将视网膜层漂洗后再移入到3%胰蛋白酶中进一步消化。应用蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法，成功制备了不同实验动物的视网膜血管铺片。

视网膜血管铺片制备过程中，应注意以下几点：①眼球的固定：大、小鼠眼球取材后直接固定于10%中性福尔马林24 h以上。狗和猴眼球组织结构特殊，各部分组织结构的软硬度不同，因此取材后立即固定4 h，再用锋利的刀片在眼球的上下部各切开一个小口，继续固定24 h。由于固定液易造成视网膜血管的断裂，因此固定时间最好不超过72 h。②视网膜的剥离：视网膜位于眼球壁的内层，组织比较薄，而且附着在色素层上，剥离过程中很容易破碎。因此去除晶状体后，以视神经乳头为中心，将眼球壁剪开成若干等份，轻轻剥离出视网膜。③血管的消化：消化过程中，随时注意观察。蛋白酶K消化能力极强，每5 min轻微摇动一次，再以最低完成消化时间为观察起点，每2 min轻柔摇动一次，待肉眼可见感光层脱落即可终止消化。换成胰蛋白酶消化时，每10 min轻微摇动一次，再以最低完成消化时间为观察起点，每5 min轻柔摇动一次，待可见半透明血管网即终止消化。④铺片：将消化好的血管网漂洗干净，平铺于含多聚赖氨酸的载玻片上，不要将载玻片上的水吸干净，否则未贴壁的血管网漂移，影响对血管走向的观察。⑤抗原修复：常规微波修复石蜡切片需要高火3 min，中火5 min，再低火3 min。而视网膜血管铺片只需中火5 min即可完成抗原修复。

蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法制备大鼠视网膜血管铺片成功率高，稳定性好，同时也适用于不同实验动物，为视网膜血管性疾病的研究提供了重要途径。

参考文献：

[1]李彦红，朱华，徐艳峰，等. 过敏性紫癜兔模型的免疫学改变及机制初探[J].中国实验动物学报. 2013, 21(6): 65-69.

[2]朱华，徐艳峰，刘颖，等. 链脲佐菌素诱导糖尿病恒河猴胰岛细胞数量的变化[J]. 中国比较医学杂志. 2012, 22(12): 1-3.

[3]Kuwabara T, Cogan DG. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture [J]. Arch Ophthalmol.1960, 64(6): 904-911.

[4]Ashton N. Studies of the retinal capillaries in relation to diabetic and other retinopathies [J]. Brit J Ophthal.1963, 47(9): 521-538.

[5]Hammes HP, Lin J, Renner O,etal. Pericytes and the pathogenesis of diabetic retinopathy[J]. Diabetes. 2002, 51(10): 3107-3112.

[6]Ruberte J, Ayuso E, Navarro M,etal. Increased ocular levels of IGF-1 in transgenic mice lead to diabetes-like eye disease[J]. J Clin Invest. 2004, 113(8):1149-1157.

[7]HuangHuang Q, Wang S, Sorenson CM, et al. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration[J]. Exp Eye Res. 2008, 87(3): 226-241.

[9]Zhu Y, Zhang XL, Zhu BF,etal. Effect of antioxidant N-acetylcysteine on diabetic retinopathy and expression of VEGF and ICAM-1 from retinal blood vessels of diabetic rats[J]. Mol Biol Rep. 2012, 39(4): 3727-3735.

〔修回日期〕

技术方法

A modification of retinal vascular preparation

XU Yu-huan1，XU Yan-feng1，LIU Ying1，HUANG Lan1，LI Yan-hong1，

HAN Yun-lin1，DENG Wei1，XU Qing-gang2，QIN Chuan1，ZHU Hua1

(1. Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of medical Sciences. Key Laboratory of Human

Disease Comparative Medicine, Ministry of Health, Key Laboratory of Human Diseases Animal Model, State

Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100021, China; 2. Beijing Tongren Hospital Capital

Medical University, Beijing 100730, China)

【Abstract】ObjectiveTo improve the method of retinal vascular preparation and application in experimental animals of mice, rats, dogs and monkeys. Methods The retinal vessels were isolated with proteinase K-trypsin digestion technique. The samples were stained by hematoxylin-eosin(HE) and Periodic-Acid Schiff(PAS). The expression of CD31 and VEGF were detected by immunohistochemistry(IHC). ResultsThe spread sheets of vascular network are complete, and can clearly show the blood vessels. No nerve tissue residue is left. Different levels of vascular morphology are clear. The vascular branches are clear and complete with no fracture. The cell morphology is intact, and the cell nucleus is clearly dispayed. The entire process can be completed in a short time, and has a high success rate. The vascular antigen are successfully retained: Expression of CD31 can be seen in both pericytes and endothelial cells; VEGF is mainly expressed in endothelial cells. ConclusionsThe improved method is successfully applied in different experimental animals. This approach will provide an important contribution to the retinal vascular disease research.

【Key words】Retinal vascular preparation；Combined digestion；Antigen retrieval

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.005.012

【中图分类号】R332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856(2015) 05-0051-04

[通讯作者]朱华(1971-),女，主任技师，研究方向：病理与病理生理学。E-mail： zhh@cnilas.org。

[作者简介]徐玉环(1980-),女，初级技师。E-mail: yuhuanxu1109@163.com。

[基金项目]国家重点基础研究发展计划(973项目)(2011CB504903)。