粒细胞集落刺激因子对阿尔茨海默病大鼠脑内炎症的影响

李　健　米永杰　石　钊　聂　政

(成都医学院解剖组胚教研室，四川　成都　610500)



粒细胞集落刺激因子对阿尔茨海默病大鼠脑内炎症的影响

李健米永杰石钊聂政

(成都医学院解剖组胚教研室，四川成都610500)

摘要〔〕目的探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗阿尔茨海默病(AD)大鼠对脑内炎症反应的影响。方法54只Wistar雄性大鼠(3～4个月龄)，随机选取18只作为正常组、36只制作AD大鼠模型成功后采用随机数字表法各选取18只分别作为治疗组、模型组；模型组和正常组采用HE染色法对大脑皮层组织进行观察，治疗组给予G-GCS(0.3 ml·kg-1·d-1)，模型组和正常组分别给予等量磷酸盐缓冲液(PBS)注射，又分别于第7、14、21天进行相关指标的检测并进行组间比较。结果正常组治疗第7、14、21天的大脑皮层细胞IL-1β染色光密度值均显著低于模型组、治疗组(P<0.05)，治疗组治疗14、21 d后大脑皮层细胞IL-1β染色光密度值低于模型组(P<0.05)。 正常组治疗第7、14、21天的大脑皮层细胞TNF-α染色光密度值均显著低于模型组、治疗组(P<0.05)，治疗组治疗14、21 d后大脑皮层细胞TNF-α染色光密度值低于模型组(P<0.05)。 结论AD大鼠对脑内炎症反应作用显著增强，G-CSF可以有效降低AD大鼠的炎症反应作用，对大鼠大脑皮层细胞具有一定的保护作用。

关键词〔〕粒细胞集落刺激因子；阿尔茨海默病；炎症反应

第一作者：李健(1978-)，女，硕士，副教授，主要从事神经系统退行性病变研究。

阿尔茨海默病(AD)主要病理改变为大脑弥散性萎缩和神经细胞变性，并且以记忆障碍、失言、失认、执行功能障碍和行为改变等全面性痴呆为主要临床特征〔1，2〕，该病发病缓慢且呈进行性发展〔3〕。目前临床上对该病的治疗包括控制伴发的精神病理症状和改善患者认知功能，但其治疗效果差强人意〔4〕。研究表明神经炎症在AD的发病机制中发挥重要作用，而近年来研究发现粒细胞集落刺激因子(G-CSF)具有神经保护作用〔5〕。本文探讨G-CSF对AD大鼠脑内炎症的影响。

1材料与方法

1.1实验动物54只Wistar雄性大鼠(3～4个月龄)，体重250～300 g，平均(273±10.4)g，均喂养于(23～25)℃、湿度40%～60%、光照12 h的环境中，自由进食进水。

1.2动物模型制作方法随机选取18只作为正常组，36只制作AD大鼠模型成功后编号采用随机数字表法各选取18只分别作为治疗组、模型组；不对正常组实施任何手术措施，用 10%水合氯醛腹腔注射治疗组和模型组大鼠，待大鼠麻醉后将其头部固定在立体定向仪上，对手术区进行常规消毒，从头背中部实施纵向切口手术，暴露出颅骨，采取颅钻钻开手术区颅骨。手术分两步：第一步刀尖按前后(AP):1.8 mm、外侧(L):2.5 mm、腹侧(V):5.5 mm的坐标插入后，以3 mm的幅度上下抽动刀片10次。接着把刀尖上升1 mm 后，内进1 mm，以3 mm的幅度上下抽动刀片10次，确保穹窿海马伞(FF)被完全横断。最后上提刀片确定无出血的情况下用骨蜡封闭创口，并在切口处撒少许青霉素粉剂进行抗炎，缝合皮肤。所有进行手术的大鼠于术后第14天开始行Morris 水迷宫定位航行训练，连续记录5 d大鼠的逃避潜伏期成绩，取平均数，若治疗组和模型组的大鼠成绩明显高于正常组，则证明建模成功。

1.3实验仪器与药品医学超净工作台购自苏州长留净化科技有限公司、大鼠脑立体定位仪购自上海益联科教设备有限公司、OLYMPUS 照相显微镜购自日本 SONY 公司、RM2245 石蜡切片机、HI1210 组织烘片机、HI1220 组织摊片机、EG1150H 组织包埋机购自上海徕卡仪器有限公司，Morris 水迷宫箱(中国医学科学院)、0.9%生理盐水、10%水合氯醛、手术器械等。

1.4实验方法正常组及模型组腹腔注射0.3 ml·kg-1·d-1磷酸盐缓冲液(PBS)，治疗组腹腔注射 0.3 ml·kg-1·d-1的G-CSF，均连续注射7 d。

1.5大脑皮层组织的HE染色于最后1次给药结束后灌注取脑：用10%水合氯醛将大鼠麻醉后仰卧固定，暴露出心脏，将输液针刺入大鼠的左心室，剪开右心耳后用250 ml预热过的0.9%生理盐水灌注，接着换成200 ml pH7.4的4%多聚甲醛灌注，待大鼠四肢抽搐僵硬时开颅取脑，并用上述灌注液固24 h。24 h过后使用常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。制备成厚度为4 μm的连续石蜡切片，最后行 HE染色。在光学显微镜下观察各组皮层的病理形态学变化并拍照。

1.6免疫荧光检测方法将制作完好的石蜡切片脱蜡、水化；制备新鲜的pH7.4的PBS缓冲液冲洗切片，进行抗原修复；取出切片后逐张滴加 50 μl的过氧化酶阻断液室温孵育20 min后用PBS 反复冲洗3 遍，每次冲洗5 min；除去多余的 PBS 液后每张切片滴加50 μl的正常非免疫动物血清室温孵育20 min后将正常非免疫动物血清洗净，每张切片滴加 50 μl的一抗〔白细胞介素(IL)-1β 和肿瘤坏死因子(TNF)-α的一抗〕，于4℃孵育过夜。第2天用新鲜配制的PBS 冲洗3次，每次冲洗5 min。除去多余的 PBS 液后每张切片滴加50 μl的一抗，室温下孵育40 min。孵育结束后使用PBS 冲洗3次，每次冲洗5 min。除去多余的 PBS液每张切片滴加50 μl的链霉素抗生物素-过氧化物酶液，室温下孵育40 min。PBS 冲洗后用二氨基联苯胺(DAB)显色具体显色步骤如下：洗净PBS液后再切片上滴加适量的DAB溶液，在光学显微镜下持续观察，直至观察到满意的染色程度。

1.7免疫图像分析分别于治疗后第7、14、21天处死各组6只大鼠，每只小鼠切去6张冠状面切片，每一张切片在预定区域内拍摄200张照片，采用随机的方法取其方形区域内的阳性细胞进行计数，拍片脑区为大鼠大脑皮层，采用IPP5.1医学图像分析软件系统分析其荧光光密度值(IOD)。

2结果

2.1正常组、模型组大脑皮层组织HE染色观察正常组大脑皮层组织HE染色结果，可见解剖结构完整、形态正常、细胞分布均匀、神经元细胞体呈圆形或锥形，细胞的轮廓清楚，细胞排列紧密、有序、细胞核淡染，核仁明显。模型组脑皮层组织可见大量散在的固缩凋亡细胞，细胞体积缩小、胞质浓缩、细胞核变小。见图1。

2.23组大脑皮层组织免疫荧光染色IL-1β染色结果正常组治疗第7、14、21天的大脑皮层细胞IL-1β染色光密度值均显著低于模型组、治疗组(P<0.05)，治疗组治疗14 d、21 d后大脑皮层细胞IL-1β染色光密度值低于模型组(P<0.05)。见表1和图2。

正常组

模型组

图1正常组和模型组脑皮层组织HE染色(×400)

±s,IOD，n=18)

组别治疗7d治疗14d治疗21d正常组38.29±8.6739.28±10.2439.12±11.46模型组93.26±17.851)146.28±21.941)86.75±14.271)治疗组89.57±15.971)65.25±12.051)2)53.29±13.071)2)

与正常组比较：1)P<0.05，与模型组比较：2)P<0.05；下表同

图2　各组大脑皮层组织IL-1β免疫荧光染色(标尺50 μm)

2.33组大脑皮层组织免疫荧光染色TNF-α染色结果正常组治疗第7、14、21天的大脑皮层细胞TNF-α染色光密度值均显著低于模型组、治疗组(P<0.05)，治疗组治疗14、21 d后大脑皮层细胞TNF-α染色光密度值低于模型组(P<0.05)。见表2和图3。

表23组大脑皮层组织免疫荧光检测

±s,IOD,n=18)

组别治疗7d治疗14d治疗21d正常组58.14±12.0656.17±11.3055.02±12.29模型组99.17±18.281)115.74±23.951)113.06±27.081)治疗组95.02±17.141)84.02±14.271)2)62.95±15.221)2)

图3　3组大脑皮层组织TNF-α免疫荧光染色(标尺50 μm)

3讨论

流行病学研究显示，在发达国家，AD是继心脏病、肿瘤和脑卒中后的第四大致死性疾病，而研究数据表明在我国约有500万人群患有AD〔6，7〕。目前临床上对AD的治疗以药物治疗为主，具体包括以下几个方面：①改善胆碱能系统的药物：AD患者的脑组织内尤其是额叶皮质和海马的胆碱能系统受到损害，导致乙酰胆碱水平降低，此类药物主要包括乙酰胆碱前体药物(盐酸乙酰L-肉碱)，胆碱酯酶抑制剂(他克林、多奈哌齐、加兰他敏)，乙酰胆碱M1受体激动剂(沙利定、占诺美林等)，②谷氨酸受体拮抗剂：兴奋谷氨酸能神经系统可以引起神经元兴奋性中毒，因此，拮抗谷氨酸受体可以保护神经元。具体包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂和美金刚等；③抗β淀粉样蛋白(Aβ)治疗：Aβ积聚是导致AD病变的始动原因和中心环节，而Aβ是β淀粉样前体蛋白经过三种不同的分泌酶(α、β、γ)水解而来，因此这三种酶的抑制剂可以成为治疗AD的靶点。④抑制tau蛋白磷酸化药物：利用GSK3β反义核苷酸阻断Aβ诱导的tau蛋白磷酸化可能延缓AD的进展；⑤抗炎药物：炎性反应参与了AD的病理改变，应用抗炎药物能够抑制Aβ沉积和老年斑形成，具体包括吲哚美辛、阿司匹林等非甾体类抗炎药；⑥神经营养及生长因子：神经营养因子可以维持神经系统的功能和促进神经系统的发育，常应用神经生长因子；⑦激素类药物：褪黑激素可以通过提高谷胱甘肽还原酶的活性而清除自由基，可以抑制tau蛋白的磷酸化，抑制神经细胞凋亡和Aβ聚集〔8〕。此外，抗氧化剂、钙离子拮抗剂和脑代谢改善药都被应用于AD的治疗〔9〕。

G-CSF是一种由207个氨基酸组成的低分子糖蛋白，通过特异性地与G-CSF受体(G-CSFR)结合而调节粒细胞生长因子，由于其具有促进粒细胞和造血干细胞增殖分化的作用而被用于粒细胞减少症的治疗〔10〕。G-CSF在神经细胞、胶质细胞和中性粒细胞中表达较多，在抗细胞凋亡和抗炎方面具有较强的作用。研究发现，G-CSF可以通过以下几个方面来发挥神经保护功能：①提高脑缺血坏死区细胞的存活率和减少坏死区面积；②分泌神经因子和促进血管、神经生成来促进神经功能恢复；③通过对多条抗细胞凋亡途经进行调节而增加神经元细胞和胶质细胞的存活率；此外，G-CSF 还能减少IL-6、IL-8和TNF-α的释放而减轻炎性反应〔11,12〕。本项研究表明G-CSF能够通过抑制IL-1β和TNF-α的表达而发挥抗炎作用，对AD大鼠大脑皮层神经元具有保护作用。这可能是由于G-CSF具有减轻小胶质细胞和Aβ沉积所致神经炎症的功能，此外，G-CSF还可以抑制炎症因子进入脑内造成神经炎症，从而发挥保护脑组织的功能。

参考文献4

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〔2014-11-07修回〕

(编辑苑云杰)

The effect of G-CSF on brain inflammation in rats with Alzheimer's disease

LI Jian,MI Yong-Jie, SHI Zhao,etal.

Department of Anatomy and Histoembryology,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,Sichuan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of granulocyte colony stimulating factor(G-CSF)on the inflammatory reaction in the brain of rats with Alzheimer's disease(AD).Methods60 Wistar male rats(3 to 4 months of age)were randomly selected as normal group(n=21),the remaining 39 were established AD rat model to as treatment group and model group(18 each group);the three AD rats and 3 normal rats were observed on cerebral tissue using HE staining,the treatment group was given G-GCS(0.3 ml·kg-1·d-1),control and normal group were given equal volume of PBS injection,the index were detected on the 7th,14th and 21st day.ResultsThe brain cortical cells of IL-1 beta staining optical density values in normal group in 7,14,21 d were significantly lower than those of model group,those of treatment group were lower than those in model group(P<0.05).TNF alpha staining color density values of normal group in 7,14,21 d were significantly lower than those of model group(P<0.05),those of treatment group were lower than those of model group(P<0.05).ConclusionsThe effect on the cerebral inflammatory reaction in AD rat is significantly enhanced,G-CSF can effectively reduce the inflammatory reaction of AD rats presenting protection on brain cortical cells.

【Key words】Granulocyte colony stimulating factor;Alzheimer disease;Inflammatory reaction

基金项目：四川省教育厅重点项目(14ZA0231)；四川省发育再生重点实验室专项基金(No.SYS10-006)

中图分类号〔〕R392-3〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)24-7027-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.027