转录组测序技术在中医药领域的应用△

张晓萌，李健春，王琼，罗春

(1.中国人民公安大学医院，北京 100038；2.四川医科大学，四川 泸州 646000；3.成都温江区人民医院 内一科，四川 成都 611130)

转录组测序技术在中医药领域的应用△

张晓萌1，李健春2，王琼2，罗春3*

(1.中国人民公安大学医院，北京 100038；2.四川医科大学，四川 泸州 646000；3.成都温江区人民医院 内一科，四川 成都 611130)

近年来，分子生物学技术已广泛应用于中医药研究，以转录组测序技术为基础的中医及中药相关研究受到越来越多研究者的青睐。本文总结了转录组学的特点、技术方法，对转录组测序技术在中医证候学、中药复杂体系、中药材鉴别及其功能基因研究中的应用现状进行了综述。

中医药；分子生物学；转录组学

中医是我国的国粹，是中华民族智慧的结晶，其理论在实践中得到不断的修正、补充和完善。然而，由于中药成分复杂、作用机制不明确等因素影响了中医药国际化的发展。为了推动中药国际化和现代化的进程，分子生物学技术被广泛应用于中医及中药研究的各领域，并逐渐扮演着越来越重要的角色。从分子水平研究中医辨证论治理论，探讨中医药的作用机制，有望推动中医药领域的发展，为中医药的发展开辟新的道路。功能基因组学尤其是转录组学(Transcriptomics)的研究理论及技术方法应用于中医药研究，对中医药的发展具有重要推动作用[1]。

1 转录组的概念、特点和相关方法

转录组是指在某个特定生长周期或生理条件下，某个细胞或组织基因组所转录出来的核糖核酸(RNA)总和，包括编码蛋白质的mRNA和非编码RNA(ncRNA)，如rRNA、tRNA、microRNA等。与基因组相比，转录组的特点表现在：1)具有时间性和空间性特征。与基因组不同，转录组受外源和内源因子调控，其基因转录情况会随生长周期、生理条件和外界环境改变而变化[2]，如干细胞和成熟分化的细胞，虽然基因组完全相同，但是基因表达谱却存在显著差异；2)信息量相对较小。转录组是以基因组DNA为模板，合成RNA为来源，但由于仅有少量的基因组DNA被转录，信息量大大缩小，如人类mRNA仅占全基因组总长度的1.5%。

通过分析转录组，可以揭示基因表达与一些生命现象之间的内在联系，对理解机体发育和进化具有重要作用。近年来，人们对转录组的研究逐渐深入，已建立了多种转录组测序技术，主要有：DNA芯片技术(Gene chip)、大规模平行测序技术(MPSS)、基因表达序列分析(SAGE)以及高通量测序技术等。高通量测序技术近些年发展迅猛，目前主要有以寡核苷酸连接和检测法(SOLID)、454技术、Solexa等为代表的第二代测序技术和以单分子实时(SMRT)、基于荧光共振能量转移(FRET)测序、纳米孔单分子等为代表的第三代测序技术。转录组学的发展为相关研究开辟了新的道路，但其不可否认也存在着一些缺陷，如测序成本过高、如何对获得的大量数据进行分析等，这些问题亟需研究解决。

2 转录组测序技术在中医药领域的应用

转录组学研究作为一种宏观的整体论方法，改变了单个基因的研究模式，将基因组学研究带入了高速发展的时代[3]。以往对中医学的研究多是单基因研究，忽略了从整体水平阐明中医药的各种问题。将转录组学应用于中医药领域，结合了转录组学具有的整体性、时空性等特点，有利于从基因水平解释中医辨证论治理论和中医药作用机制等问题。

2.1 转录组测序技术在中医证候学研究中的应用

辨证论治作为中医学临床诊治疾病的主要方法，是中医学的精髓。由于对证候的判定往往缺乏深层次的客观标准，所以“证”的确立与临证医家的思辨能力和诊疗水平密切相关，很难做到真正意义上的客观化和量化[4]。此外，证候的表达是机体反应、整体调控后通过基因功能和相关通路表达出来的，证候是基因组对外界刺激所引起的整体运动的综合反映[5]，单一的指标并不能作为其判断标准。鉴于中医学和转录组学皆注重整体性，因而引入转录组学的技术方法有望攻克上述两大难题。

近些年来，已经有很多研究试图将转录组技术引入证候诊断中，作为证候诊断的客观指标。陆明等[6]用基因芯片研究了虚寒症肢冷患者基因表达差异，发现与能量代谢相关的有6条，且集中于氧化磷酸化能量通路。严石林等[7]通过对慢性肾炎、糖尿病肾病、阳痿3种疾病的肾阳虚证的转录组学特征进行分析，发现共同差异表达基因有332条，与肾阳虚证相关的共同信号通路有37个。受此研究启发，管艳等[8]通过基因芯片技术比较乙肝肝肾阴虚证和肝郁脾虚证患者白细胞基因表达差异，发现两者基因表达存在明显差异。这些差异表达的研究为中医“异病同证”观点提供了理论依据。若能在不同证候基因差异表达的基础上建立中医证型数据库，则能对病人证候精准、快速地诊治，真正意义上实现中医现代化、国际化。

2.2 转录组测序技术在中药复杂体系研究中的应用

中药的临床应用形式多以复方为主，对其研究不仅只需要考虑单味药作用，更需要考虑各单味药的相互作用及其整体效应，研究难度很大。因此，中药复杂体系的研究需要以中医传统的理论体系为指导，借助现代生物医学的研究方法，通过多视角切入、多技术辅助、多学科交叉渗透，才能够全面、系统、准确地阐明中药及其复方的作用靶点、作用环节和作用过程[9]。转录组学技术为中药复杂体系的研究提供了新的手段，迄今为止，已有不少研究者在其思路指导下开展对中药复杂体系的研究，并已取得一定成果。

失神经肌萎缩是指周围神经损伤后，骨骼肌因失去神经营养作用,出现肌萎缩的症状。周岚等[10]用补阳还五汤治疗大鼠腓总神经夹伤模型，用基因芯片技术筛选差异表达基因，发现基因表达差异明显，上调表达基因14条，下调表达基因10条，并用实时荧光定量PCR(RT-PCR)与免疫印迹验证了补阳还五汤增强了PI3K基因与蛋白的表达。该研究初步揭示了补阳还五汤延缓失神经肌萎缩的分子机制。金龙胶囊是国内首例抗癌的复方鲜中药剂，临床上用于治疗肝癌，疗效确切，亦对脑肿瘤有一定改善作用。黄卉等[11]用基因芯片联合RT-PCR方法评估金龙胶囊抗脑肿瘤的药效及其作用机制。发现表达2倍以上上调表达基因48个，其中上调最明显基因为VNN1，上调倍数高达48.34倍。说明金龙胶囊可能通过上调VNN1表达发挥抗脑肿瘤的作用机制。段铮等[12]在用基因芯片研究消瘤保肺丸对肿瘤转移相关基因表达的影响中发现，有30多个基因表达上调大于1.5倍(包括DCC、GPNMB、MCAM、ETV4、FN1等)，提示中药对肺癌转移的调控是多层次、多靶点的。谢林等[13]用基因芯片研究补肾益肝活血方对小鼠骨髓基质细胞成软骨分化相关基因表达的影响，发现了软骨代谢相关的两个重要基因Eefmp1、Mmp3存在明显差异表达，说明补肾益肝活血方治疗骨关节炎的作用机制可能与从EFEMP1、MMP3介导的相关通路有关。这些研究从多基因差异表达的角度探索中药的作用机理，为进一步阐明中药复杂体系的研究奠定了基础。

2.3 转录组测序技术在中药材鉴别中的应用

药材的准确鉴别是确保药材质量的第一步，但常规的方法对缺乏完整的形态结构或参假复方制剂往往难以鉴定。转录组测序技术具有高效、快速、敏感、不受环境改变影响等特点，其有望替代传统方法成为药用动植物分类鉴定、识别假冒伪劣药材的新方法。

蒋超等[14]用忍冬及其变种红白忍冬经转录组测序技术(RNA-Seq)测序获得的表达序列标签(EST)序列，经生物信息学手段筛选出87对重复次数具有差异的表达序列标签-简单重复序列(EST-SSR)，进一步筛选获得3对可准确鉴别忍冬及其变种、山银花原植物的引物：jp.ssr4、jp.ssr64及jp.ssr65。亦有研究者根据SSR多态性信息初步鉴定淫羊藿[15]、人参[16]等品种。Carles等[17]用基因芯片技术鉴定了几种有毒中药。Zhang YB等[18]用基因芯片技术鉴别了复方药材中石斛的不同种属，并制作了16个鉴定不同种属石斛的基因芯片。

2.4 转录组测序技术在中药材活性成分生物合成及调控研究中的应用

研究转录组信息可发现，许多中药材可能参与次生代谢产物生物合成，调节植物生长发育及环境响应的基因，为鉴定中药材参与有效成分生物合成的功能基因提供极为丰富的参考资料。

张争等[19]用454技术对机械损伤后的白木香木质部转录组进行测序和功能分析，发现了新Unigene 13 611条。通过同源性搜索，获得参与沉香倍半萜合成相关Unigene 26条，获得200余条可能编码转录因子的Unigene。Wenping H等[20]用Solexa技术获得鼠尾草Unigene 56 774 条，其中有1539条可能参与5个主要次级代谢合成通路。Li Y等[21]通过对甘草的转录组数据分析发现，分别可能与甘草酸骨架合成相关的酶的基因16个、甘草酸合成的基因9个。Xu Z等[22]用SMRT技术结合新一代测序技术(NGS)对丹参根不同组织转录组进行研究，通过对转录组水平分析，发现丹参酮主要在根周皮组织产生并累积。

3 结语

中医药是我国古老的文化瑰宝，中医药现代化是将中国传统医药的优势与现代科学技术紧密地结合起来，继承传统，走出传统，走向现代。应用转录组测序技术对中医药领域进行系统性研究，从现代分子生物学角度为中医药理论提供强有力的支撑，将会对中药现代化起到重要的作用，加强西方社会对中医药的认识。但是中医药转录组研究也存在许多亟需解决的问题，如建立中医证候疾病模型动物难度大、转录组学分析的局限性(蛋白质作为生命活动的执行者，往往须经过翻译后修饰才能成为功能蛋白，但RNA转录量不变)等。因此，须结合众多新兴组学，例如蛋白质组学和代谢组学的研究[22-25]，多视角切入，多技术辅助，帮助人们更深层次地认识中医药学。

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ApplicationofTranscriptomeSequencingTechnologyinTraditionalChineseMedicine

ZHANGXiaomeng1，LIJianchun2，WANGQiong2，LUOChun3*

(1.TheChinesePeople’spublicsecurityhospital，Beijing100038，China；2.SichuanMedicalUniversity，Luzhou646000，China；3.ThePeople’sHospitalofWenjiangDistrictinChengdu，Chengdu611130，China)

In recent years，molecular biology technology has been widely applied in traditional Chinese medicine (TCM).Based on the transcriptome sequencing technology，many TCM researchers focus their study on it.This paper summarized the characteristics of the transcriptomics，the methods and the applications in the TCM syndrome，the complex system in Chinese herbal medicine，the identification of Chinese herbal medicine and its functional gene research.

Traditional Chinese medicine；molecular biology；transcriptomics

2015-06-21)

人因工程重点实验室开放基金资助项目(HF2012-K-06)；四川省科技厅-泸州市人民政府-泸州医学院联合科研资金项目(14JC01323-LH50)

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罗春，主治医师，研究方向：中药药理学；E-mail：328322357@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.033