马尾藻多糖脂质体纳米制剂对南美白对虾抗病力的影响

崔月明　胡庭俊　秦津等

摘要：研究马尾藻多糖脂质体对南美白对虾免疫功能及抗病毒活性的影响。首先，选用72尾SPF南美白对虾，分为脂质体组和对照组，饲喂7 d后，测血淋巴上清中总蛋白含量，酚氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性；然后，选用2批180尾SPF南美白对虾分别观察多糖脂质体对感染白斑综合征病毒或桃拉病毒对虾的保护作用，将180尾对虾随机分为6组，设空白对照组、阳性对照组，药物阳性对照组和高、中、低3个脂质体剂量组，饲喂7 d后攻毒，攻毒后观察7 d，记录发病数、死亡数。结果表明，在免疫试验中，脂质体组酚氧化酶、溶菌酶和碱性磷酸酶的活性极显著升高；在抗病毒保护试验中，多糖脂质体各剂量均能提高南美白对虾的存活率，高剂量组存活率最高。说明马尾藻多糖脂质体对南美白对虾具有免疫促进作用，并能提高其抗病力。

关键词：马尾藻多糖；脂质体；南美白对虾；免疫；病毒病

中图分类号：S945.4+9 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0323-03

收稿日期：2014-11-20

基金项目：广西科学研究与技术开发计划（编号：桂科攻0992014-6）。

作者简介：崔月明（1980—），女，河南南阳人，博士研究生，讲师，研究方向多糖免疫药理学。E-mail：870180417@qq.com。

通信作者：胡庭俊，博士，教授，研究方向为中药免疫药理学。E-mail：tingjunhu@126.com。对虾白斑综合征（WSS）和桃拉综合征（TS）是危害我国对虾养殖业最多的两大病毒病，其大面积的暴发严重危害了对虾养殖业的发展。2001—2006年对南美白对虾养殖的主产地10个省份的流行病学调查研究显示，在所有检测到的病毒性疾病中白斑综合征病毒（WSSV）占63.84%，桃拉综合征病毒（TSV）占32.74%，成为危害最大的2种病毒病，并且其死亡率也呈现逐年递增的趋势[1]。2009—2010年在福建、海南和广东的流行病学调查中，对虾WSSV的阳性结果占27.1%，它和传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）同时呈现阳性的占16.95%[2]。针对这种病毒性疾病的大面积暴发，目前还没有有效的救治方法，因此对病毒病的有效防治已成为对虾养殖中的最主要问题[3]。对虾和其他无脊椎动物一样， 缺乏脊椎动物特异的抗原/抗体免疫反应机制， 虽然一些病毒的重组蛋白能够诱导特异的免疫反应，但这种保护作用只是暂时的[4]，因此完全寄希望于通过疫苗免疫来控制虾病是不切实际的。目前对病毒病的防治还是以防为主，报道称中草药类多糖、生物碱、有机酸、酮类等以及益生菌能激活对虾的免疫系统， 增强抗病力，从而达到防病治病的目的[5]。杨明用乌梅为主要材料的中药抗病毒复方饲喂南美白对虾，其中2%剂量的试验组促进对虾的生长最明显，酚氧化酶（PO）和过氧化物酶活性亦大大提高，表明中药复方能提高对虾的非特异性免疫力；在WSSV感染试验中，免疫保护率更是达到61.98%，效果极显著[6]。

马尾藻多糖（SP）作为海藻中一类具有较高抗病毒活性的硫酸多糖，添加在饲料中，不仅能促进南美白对虾的生长，而且对甲壳动物的酚氧化酶系统具有激活作用，能提高南美白对虾酸性磷酸酶（ACP）、 超氧化物歧化酶（SOD）及溶菌酶（LSZ）活性，并且在感染WSSV后，使免疫保护率从28%提高到74%[7]。脂质体是将药物包封于类脂质双分子层而制成的一种超微型球状药物载体制剂，结构类似生物膜，和靶细胞之间可通过内吞、融合、接触释放、吸附、脂质交换等方式起作用，具有减少药物治疗剂量、降低药物毒性、减轻变态反应和免疫反应、延缓释放、靶向给药等优点[8]。多糖脂质体作为免疫增强剂在提高对虾的非特异性免疫，增强对病毒性疾病的抵抗力方面，目前国内外都未见报道。马尾藻多糖脂质体纳米制剂（SPL）是将溶解的马尾藻多糖包封于磷脂双层膜中，形成稳定的球形纳米乳剂。本试验通过在南美白对虾饲料中添加SPL，测定对虾血淋巴液上清中总蛋白（TP）含量，酚氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶的活性，探讨SPL对南美白对虾非特异性免疫功能的调节作用；而后人工感染WSSV和TSV，观察SPL对南美白对虾抗病力的影响，评价SPL作为免疫增强剂在对虾养殖中的作用，为SPL的进一步推广应用提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1药物0.5%马尾藻多糖脂质体纳米制剂，由广西大学动物科学技术学院制备。对照药：盐酸左旋咪唑+黄芪多糖可溶性粉，湖南湘大兽药有限公司生产，商品名为瘟毒清，生产批号为20110680。

1.1.2试验动物SPF南美白对虾的幼虾500尾，取自广西水产研究所南美白对虾企沙养殖基地，暂养7 d后量体长、称质量，体长为（4.5±0.55） cm，体质量为（0.69±0.31） g，挑选规格基本一致的用于试验。

1.1.3饲料对虾饲料为豆粕、鱼粉、面粉、虾粉、鱼油、麦麸、多维多矿、大豆磷酯组成的对虾基础饲料，试验组按不同剂量将SPL喷涂于饲料上。

1.1.4病毒对虾白斑病综合征病毒、桃拉综合征病毒均由广西壮族自治区水产研究所保存，二者的TCID50均为10-6。

1.2试验方法

1.2.1试验分组及处理将72尾SPF南美白对虾分为2组——对照组和SPL组。对照组饲喂基础饲料，SPL组饲料添加SPL 50 mL/kg，连续饲喂7 d。2组分别饲养于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱内，上午、下午各投料1次（按对虾体质量的5%投料），常温下喂养。

1.2.2血淋巴液制备用药后8 d，用带5号针头的1 mL注射器自虾的头胸甲后插入心脏取血淋巴液0.3 mL，置于 Eppendorf 管中，4 ℃冷藏，3 000 r/min 离心10 min，取上清用于免疫指标测定。

1.2.3免疫指标测定用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定对虾血淋巴液上清中总蛋白含量，以及溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活力；酚氧化酶活性用改进的Ashida方法[9]，以L-dopa为底物，反应时间6 min，测定490 nm下的吸光度。

1.2.4攻毒保护试验将360尾SPF南美白对虾分成2大组，分别做SPL对WSSV和TSV的攻毒保护试验。将每大组的180尾SPF南美白对虾随机分为6组， 每组30尾，分别是空白对照组、病毒阳性对照组、药物对照组以及多糖脂质体纳米制剂的高（200 mL/kg）、中（100 mL/kg）、低（50 mL/kg）剂量组，分别饲养于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱内。上午、下午各投料1次（按对虾体质量的5%投料），在常温下喂养7 d，饲喂8 d时按100倍TCID50的病毒量进行攻毒试验。攻毒后观察7 d，记录发病数和死亡数，计算相对保护率：相对保护率=（1-试验组死亡率/病毒对照组死亡率）×100%。

1.2.5数据处理及统计分析采用统计学软件SPSS 16.0 进行数据的显著性检验，免疫指标用独立性t检验，抗病毒保护试验用χ2检验。

2结果与分析

2.1SPL对南美白对虾相关免疫指标的影响

SPL对SPF南美白对虾免疫指标的影响结果见表1。添加SPL的试验组总蛋白含量与对照组差异不显著，而其余的相关免疫酶活性均有较大的改变，其中酸性磷酸酶活性极显著降低（P<0.01），酚氧化酶、溶菌酶和碱性磷酸酶活性极显著升高（P<0.01）。

2.2SPL对人工感染WSSV的南美白对虾的抗感染保护作用

在对虾饲料中添加SPL后，高、中、低剂量组与病毒对照组相比都降低了发病率和死亡率。其中药物对照组和SPL中剂量组的死亡数显著减少（P<0.05），SPL高剂量组死亡数极显著减少（P<0.01），相对保护率最高，达到16.67%（表2）。

2.3SPL对人工感染TSV的南美白对虾的抗感染保护作用

由表3可见，在饲料中添加中、高剂量的SPL能显著提高南美白对虾对TSV的抵抗力，使发病数显著降低（P<0.05）。SPL组的相对保护率均高于药物对照组，其中高剂量组最高，达到26.93%。

3讨论

对虾属于甲壳动物，其免疫防御系统由基本防御屏障（甲壳和表皮）、细胞防御屏障（血淋巴细胞免疫）和生理防御屏障（体液免疫）3个部分组成。对虾的体液免疫包含水解和氧化等酶类、凝集素、抗菌肽、溶菌酶等体液免疫因子，它们在甲壳动物的体液免疫过程中发挥着很大的作用，使得甲壳动物能识别非己物质，抵抗病原体的侵袭。

对虾的酚氧化酶系统（proPO）作为一种非特异性识别体系是先天性体液免疫的重要组成之一，无论从组成、激活方式还是免疫功能上，都非常类似于高等动物的补体系统，主要是通过酚氧化酶原激活系统、抗菌肽和凝集素等的作用达到抗病抑菌及消除异物的目的。本研究发现，在对虾饲料中添加50 mL/kg 剂量的SPL可以极显著增强南美白对虾血淋巴上清中的PO活性，与对照组相比PO活性提高2倍以上，说明SPL能够有效刺激大颗粒细胞脱颗粒，从而释放出酚氧化酶原激活系统的各种组分，参与免疫识别及免疫防御反应。

溶菌酶是对虾血细胞吞噬异物后分泌的一些碱性蛋白质，主要水解细菌细胞壁的糖苷键，引起细菌细胞裂解死亡，破坏和消除侵入体中的异物。本试验结果显示，饲喂含SPL的饲料7 d后，LSZ的活力极显著升高。与刘小玲等研究的桦褐孔菌多糖以及覃振林等研究的马齿苋对对虾非特异性免疫的效果[10-11]一致。

磷酸酶可以催化磷酸单脂的水解反应和磷酸基团的转移反应，从而将表面带有磷酸单酯的异物破坏降解。依据它们起催化作用的最适pH值不同，分为碱性磷酸酶和酸性磷酸酶。在本试验中，同时测定了对虾血淋巴上清液中ALP与ACP的活性，与对照组相比均有极显著差异，说明SPL影响了磷酸酶的分泌和活性。其中ALP是极显著升高，与大多数相关的研究结果[10，12]一致，而ACP的含量却是极显著降低，这可能与饲喂时间以及对虾的生长期有关。李桂英等在对虾饲料中添加肠道益生菌后发现，根据饲喂的时间不同，ACP的活性在各个时间点有较大的差异，在第10天达到最高，之后就下降了[13]；王新霞用β-葡聚糖饲喂幼虾，在第9天的时候活性明显升高，而在第14天测定时活性就下降了，甚至低于对照组[14]。除了时间因素外，还可能与脂质体的主要组成是磷脂和胆固醇有关，因为磷脂可被磷酸酶水解，二者之间可以发生化学反应。所以，本研究测定的ACP含量降低的原因还需要进一步探讨。

病毒感染对虾之后，会引起对虾的免疫防御反应[15-16]。WSSV可感染对虾颗粒细胞，使超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和诱导性一氧化氮合成酶的活性显著降低[17]；WSSV也能使对虾的酚氧化酶体系明显上调，对虾痊愈后其酚氧化酶活性降到正常值[18]，暗示病毒也会激活酚氧化酶体系，进而启动对虾的免疫反应。在TSV感染2～3 d后，对虾总淋巴细胞数、透明细胞数、半颗粒细胞数及颗粒细胞数都有大幅度下降，SOD、PO活性分别下降了约 25%、68%，这表明TSV可能通过降低对虾血液学免疫力而实现其高致病性[19]。Chang等研究发现，多糖类物质（如β-葡聚糖、脂多糖、肽聚糖等）能有效激活对虾的酚氧化酶系统，进而提高对虾自身的免疫水平，抑制体内病毒扩增，阻止未带毒个体染病，从而预防控制WSSV感染[20]。本研究利用具有抗病毒活性的马尾藻硫酸多糖制成的脂质体纳米制剂作为免疫增强剂，观察对WSSV和TSV感染后对虾的保护作用发现，SPL高剂量组可以极显著减少病死虾的数量，对WSSV感染后保护率达1667%，对TSV感染后保护率达26.93%。

本试验结果显示，饲料添加SPL 50 mL/kg，能显著提高南美白对虾的酚氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶活性，对对虾的非特异性免疫具有免疫促进作用。在人工感染WSSV和TSV后，高、中、低剂量的SPL对南美白对虾均有一定的保护作用，效果优于对照药物瘟毒清，其中高剂量组保护效果最好。说明脂质体作为一种新型的药物制剂，可以增强甲壳类动物的免疫活性，提高其抗病毒能力，有作为绿色免疫增强剂开发的潜力。

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