表达hpa1Xoo基因棉花对黄萎病抗性及农艺性状的影响

刘悦　金中时　王凤良等

摘要：黄萎病是棉花生产中最具毁灭性病害之一，种植抗病品种是控制黄萎病害最为有效途径之一。本试验通过花粉管通道法将hpa1Xoo基因导入陆地棉品系854，经多代选育获得了可稳定遗传表达hpa1Xoo基因且农艺性状稳定的2个棉花材料854-3、854-5，具有出苗快、长势较好、整齐度高、植株中等、株型松、茎秆毛少光滑、叶片大、叶色深绿、叶功能较好、结铃性较强、铃形较大、吐絮畅等特点。2013—2014年854-3、854-5株高98.0～114.0 cm，单株果枝15.60～18.10个，单株结铃26.90～48.45个，铃质量5.26～5.92 g，衣分39.54%～45.10%，籽棉产量3 186.45～5 023.65 kg/hm2，皮棉产量1 437.5～1 998.45 kg/hm2。854-3、854-5黄萎病指数分别为4.23、2.80，均为高抗水平。854-3、854-5纤维上半部平均长度分别为28.78、28.83 mm，断裂比强度分别为27.9、28.4 cN/tex，马克隆值分别为5.67、5.83，伸长率分别为6.3%、6.2%。854-3、854-5纤维外观色泽洁白，手感有弹性，内在品质优良，可为棉花抗病品种选育提供种质或材料。

关键词：转基因棉花；hpa1Xoo基因；抗黄萎病；农艺性状

中图分类号： S435.621文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0170-05

收稿日期：2015-02-06

基金项目：教育部博士点基金（编号：20104601110004、20124601110004）；国家自然科学基金（编号：31160359、31360029）；国家科技部项目（编号：2004BA901A36）。

作者简介：刘悦（1990），女，黑龙江人，硕士研究生，从事植物病理学研究。E-mail：heizi2327@126.com。

通信作者：缪卫国，博士，教授，从事分子植物病理学研究。E-mail：weiguomiao1105@126.com。在世界范围内棉花是非常重要的纤维作物，也是食用油料来源之一。是仅次于粮食的第二大农作物[1]。黄萎病是棉花成株期危害最大的病害之一。棉花黄萎病的病原菌为大丽轮枝菌（Verticillium dahlia Klebahn），对棉花质量、皮棉产量、纤维品质影响非常严重[2-3]。1993年，棉花黄萎病在我国大暴发，发病面积达266.67万 hm2，损失皮棉约1亿 kg，2002—2003年黄萎病再度暴发，棉花黄萎病已成为棉花减产的主要原因之一[4-5]。选育高产抗病品种对有效控制该类病害尤为重要。多年来，我国对筛选与培育新品种的方法不断更替革新，由开始常规棉育种至现在利用转基因、分子标记与生化辅助育种等技术，定向、高效培育出高产、抗病虫、优质的复合抗性品种[6]。如转基因Bt抗虫棉，不仅在抗棉铃虫方面有显著成效，还能够增强农业生态系统害虫自然控制的能力，世界范围内实现了大范围的推广种植[7-8]。但至今对于抗病转基因棉的研究成效甚微，未见抗黄萎病转基因棉花大面积种植的报道，生产上大面积种植的棉花品种对棉花黄萎病的抗性仍处于抗病或耐病水平，缺乏高抗黄萎病棉花品种的报道。

Wei等首次从梨火疫病菌（Erwinia amylovora）中分离和鉴定了一种能够激发非寄主植物发生过敏性反应（hypersensitive resistence，HR）的蛋白激发子，命名为harpinEa[9]。目前，人们已经在Erwinia、Psedomonas、Xanthomonas等属的多种植物病原细菌中克隆到编码harpin蛋白的hrp（hypersensitive response and pathogenicity，hrp）基因[10-17]。人们已经将编码harpin蛋白的基因成功转入到烟草、马铃薯、苹果、梨、甜菜、小麦、棉花[18-26]及水稻[15，17，27-29]等植物中，获得的转基因植物都对其主要病原菌产生了较好的复合抗性。

hpa1Xoo是来自水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）编码harpinXoo蛋白的hrp基因[17]，笔者项目组用含农杆菌T-DNA区域的重组质粒，通过花粉管通道法将hpa1Xoo基因导入多个陆地棉，结合常规育种获得具有多种有益表型如抗棉花黄萎病、枯萎病、棉铃虫等的后代株系[30]。在此基础上，2008—2014年项目组选用抗病较差但农艺性状较好的陆地棉材料854，将hpa1Xoo基因导入854，通过系统选育获得了稳定表达的后代株系854-3、854-5，在2013—2014年对854-3、854-5的黄萎病抗性、农艺性状等方面与泗棉3号、中植棉2号进行了比较，以期为棉花抗病品种选育及病害有效防控提供优良种质。

1材料与方法

1.1材料

陆地棉材料854-3、854-5是以854（江苏科腾种业有限公司提供）为转化受体的转hpa1Xoo基因棉花的遗传稳定后代株系，抗性标记基因为nptⅡ[28]。对照为中植棉2号（抗病）、泗棉3号（感病）。

1.2试剂

卡那霉素（5 000 mg/L）、胶回收试剂盒、DNA试剂盒与RNA试剂盒均购自BIOMIGA公司；反转录试剂盒购自TianGen公司；GoldView DNA染料购自北京赛百盛基因技术有限公司；引物由华大基因引物合成。DNA测序由华大基因完成。

1.3方法

1.3.1卡那霉素抗性筛选参照缪卫国的方法[31]，当棉苗长出2～3张真叶时，用5 000 mg/L浓度的卡那霉素对叶片均匀涂抹，无黄色斑痕的为卡那霉素抗性植株，以此作为阳性植株进行下一步分子筛选。

1.3.2转基因棉抗病性考察试验选择在江苏大丰大中镇红花村发病均匀的棉花黄萎病重病田进行，田间管理同大田常规方法。病情考察分2个时期进行，黄萎病第1发病峰在棉花蕾花期（7月中下旬），黄萎病第2发病峰在棉花铃期（9月下旬），调查发病率，计算病情指数，参照顾本康等的方法[32]划分抗病等级。

1.3.3农艺性状调查棉花采用育苗移栽的方式种植，4月中旬播种，5月中旬移栽。试验田采用随机区组排列，重复3次，小区长8 m、宽4 m，行距1 m，株距30 cm，每个区组设1个感病对照（泗棉3号）、1个抗病对照（中植棉2号）。调查项目包括吐絮期株高、单株果枝数、单株铃数和吐絮个数，并考察皮棉、籽棉产量、单铃质量、衣分等指标。采集植株中部铃50个，称量其纤维20～30 g送检（中国农业科学院棉花研究所农业部棉花纤维检测中心检测）。

1.3.4统计分析参照顾本康等的抗病性鉴定方法[32]，抗病性指标计算公式如下：

发病率=（∑病株数/调查总株数）×100%；

病情指数=[∑（各级病株数×相应病级）/（调查总株数×4）]×100%；

相对抗性指数（IR）=校正系数K×鉴定材料病指；

校正系数K=50/本次鉴定感病对照病指（50为感病对照标准病指）。

比较854-3、854-5这2个株系（材料）与对照品种在2013—2014年的抗病性与农艺性状，对均值进行t测验，依据测验值的显著水平确定供试材料的品质优劣。

1.3.5PCR与RT-PCR检测采用DNA提取试剂盒（E.Z.N.A. HP Plant DNA Kit）提取棉花4～5张真叶期时的叶片总DNA，参照缪卫国等方法[31]，用引物hpa1Xoo（Forward：5′-TTCGGATCCATGAACTCTTTGAACACACAATT-3′；Reverse：5′-GGTGAGCTCTTACTGCATCGATGCGCT-3′） PCR扩增目的基因hpa1Xoo全长。其程序为：95 ℃变性5 min，然后95 ℃变性45 s，56 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，此循环进行35次；最后72 ℃延伸10 min。

利用RNA提取试剂盒（E.Z.N.A. Plant RNA Kit RNA）提取花铃期棉叶的RNA，使用反转录试剂盒（Quant Reverse Transcriptase）进行RNA反转录。使用hpa1Xoo引物（同上），以反转录后的cDNA为模板进行PCR，程序同上。

2结果与分析

2.1转基因棉花的黄萎病抗性

2008年，我们采用花粉管通道法结合农杆菌介导的方法，将来自水稻白叶枯病菌编码harpin蛋白的hpa1Xoo基因导入受体陆地棉材料854[30]，通过卡那抗性和抗病性田间筛选，结合分子验证，经单株选育，获得了854-3、854-5，2个农艺表型稳定的材料。2013—2014年，继续观察854-3、854-5农艺性状和对黄萎病的抗病性。结果表明，在江苏大丰大中镇红花村棉花黄萎病重病田，抗病对照中植棉2号相对病情指数为12.41～16.68，平均为14.54，感病对照泗棉3号病情指数为42.76～50.00，平均为46.38，每年3个区组的感病对照泗棉3号黄萎病病情指数均在50左右，重复间、年度间差异不显著，表明供试黄萎病病田发病均匀，适宜做病圃开展棉花品种（材料）抗病性鉴定（表1）。854-3、854-5在2013—2014年平均病情指数分别为4.23、2.80，最高为6.01，最低为2.02，分别较抗病对照中植棉2号相对病情指数低70.9%、80.7%，较感病对照泗棉3号相对病情指数低 90.9%、94.0%，参照棉花品种抗性划分标准[32]，二者均属于高抗。

2.2转基因棉花的主要农艺性状及经济性状

2.3转基因棉花纤维品质性状

2014年，对854-3、854-5纤维样品进行品质检测，纤维品质性状良好，纤维长度分别为28.78、28.83 mm，比强度分别为27.9、28.4 cN/tex，马克隆值分别为5.67、5.83，伸长率分别为6.3%、6.2%，整齐度分别为85.4%、84.7%（表3）。

2.4PCR、RT-PCR、PCR-Southern blot检测结果

从整齐排列生长一致的株行中，分别随机选择854-3、854-5材料各2株。以叶片基因组DNA为模版，用hpa1Xoo引物进行PCR扩增（图1-A）。将上述PCR产物电泳后，以地高辛标记的hpa1Xoo全长序列为探针，进行PCR Southern blot。以水稻白叶枯菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）PXO99菌株的DNA为模板进行PCR的产物为阳性对照。PCR Southern blot结果，854-3、854-5阳性对照均在400～500 bp间出现了明显的阳性信号（图1-B）。RT-PCR检测是以随机选择854-3、854-5 2材料各4株的叶片基因组RNA为模版，反转录后，同样以hpa1Xoo引物进行PCR扩增（图2）。分子检测所得到的目的条带单一，测序结果为hpa1Xoo，表明引物特异性很高，并且经多代选育后转入的外源基因hpa1Xoo仍然能够在棉花内转录表达，在世代间稳定遗传。

3讨论

Harpin蛋白在病原菌与植物互作过程中不仅能赋予转基因植物抗病虫性，而且能够激发一些防卫基因的表达[31，33]。如能够诱导植物系统获得抗性[34]，能在多种植物上诱导过敏性细胞死亡[35]，并能够启动水杨酸[36]、茉莉酸/乙烯[37]、脱落酸[38]等信号传导途径。不仅编码Harpin蛋白的基因可以作为外源基因导入，还起到抗病虫、提高品质的作用，而且在植物上的直接施用也能够赋予植物较好的抗病性[19，39]。多年来，人们已经从多种植物病原细菌中克隆得到编码harpin蛋白的hrp基因，并成功将其转入到不同的作物中，使转基因植物获得了抗性，不同程度上提高了农作物的品质，例如将编码harpin蛋白的基因成功转入到烟草[18-21]、马铃薯[22]、苹果[25]、梨[24]、甜菜[18]、小麦[25]、棉花[26]及水稻[15，17，27-29]等植物中，获得的转基因植物都对其主要的病原菌产生了较好的复合抗性。将编码水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）编码harpin蛋白的hpa1Xoo基因转入水稻中，使得转基因水稻获得良好的复合抗性[15，17，27-29]。缪卫国将hpa1Xoo基因导入到棉花Z35中，hpa1Xoo基因的表达可以促进防卫反应，有效降低了棉花黄萎病的发生，培育筛选过程中还发现转hpa1Xoo基因棉花不仅对黄萎病有抗性，而且对枯萎病、立枯病也有很好的抗病性，对棉铃虫、棉蓟马、棉大卷叶螟也有较好的抗虫性[31]，也就是说harpin能够赋予植物多种复合抗性。本试验中笔者选取了江苏科腾种业有限公司提供的棉花材料854，该材料适于长江中下游种植，将hpa1Xoo基因转入854中，经过2008—2014年获得了适于长江中下游种植的棉花材料854-3、854-5，二者兼具高抗黄萎病及良好的农艺性状。

近年来，研究选育的棉花品种（材料）多为耐黄萎病品种，少部分为抗黄萎病品种，如冀杂1号黄萎病指数163[40]，冀棉169黄萎病指数12.5[41]，辽棉20号、辽棉25号、中棉91、辽K133黄萎病指数分别为16.3、13.0～18.85、248、20.83[42]等，现今仍缺乏高抗黄萎病的品种（材料）。利用转基因技术培育棉花抗病品种成为目前最经济有效的方法之一。不论采用常规育种还是分子育种技术培育高抗黄萎病的棉花品种，均存在一定的瓶颈，主要体现在一是缺乏高抗黄萎病的抗源，二是棉花对黄萎病菌的抗性遗传特性还存在一些理论和技术性的问题。针对黄萎病的抗性品种育种，时常会发现某一个材料或者品系在独特年份表现出较好的抗病性，但这种抗性不像对枯萎病抗性会具有较好的持久性，在后续种植过程中会发现目标品种对黄萎病的抗性又减弱或者丢失，这是困扰抗黄萎病品种选育的一个较突出的问题。目前，我们获得的854-3、854-5 2个棉花材料的黄萎病指数分别为4.23、2.80，在连续种植的2年中都保持着高抗黄萎病，农艺性状和经济性状优良，有望作为抗黄萎病品种培育过程中的种质或材料。

尽管转基因作物产业化发展速度快前景好，能为社会带来巨大的经济利益，但不可忽视的是转基因作物确实存在一系列潜在的安全问题。转基因作物安全性包括两方面：食品安全性问题和环境安全性问题。为能够安全持久种植利用转基因作物，在转基因作物商品化前要对其可能带来的环境生物安全问题进行严格、充分的科学研究和评价，并进行有效的生物安全监测和管理[43-48]。我们获得的转hpa1Xoo基因棉花均规范种植，设立了隔离带，按照相关规定对转基因品种产业化采取严格谨慎的管理和审批，在尽量消除和降低安全隐患的基础上科学利用转基因技术，以促进整个社会经济的发展。

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