红枫品种“四季红”休眠芽萌发诱导与培养

施帅男　陆叶　杨金海等

摘要：四季红红枫是一种重要的园林绿化树种，为获得足够多的外植体材料并建立“四季红”红枫的离体快速繁殖体系，分别在自然条件和离体条件下利用植物激素对休眠芽进行催芽处理。结果表明，在活体情况下喷施0.1 mg/L赤霉素能够促进休眠芽萌发。在离体培养条件下，通过在MS基本培养基中添加0.5 mg/L TDZ、1.0 mg/L BA、1.0 mg/L NAA，休眠芽萌发率最高可达到73.3%。

关键词：休眠芽；赤霉素（GA）；噻苯隆；萌发培养；萌发率；红枫

中图分类号： S687.04+3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0090-03

收稿日期：2014-11-12

基金项目：江苏省高校自然科学基金（编号：13KJA220001）；江苏高校优势学科建设工程项目（编号：PAPD）。

作者简介：施帅男（1989—），女，江苏南通人，硕士研究生，研究方向为林木遗传育种。E-mail：shishuainan99@163.com。

通信作者：施季森，教授。E- mail：jshi@njfuedu.cn。红枫品种“四季红”（Acer palmatum ‘Trompenburg）是槭树科的落叶小乔木。其叶形优美，红色鲜艳持久，树姿美观，是一种非常美丽的观叶稀有树种[1]，具有很高的开发利用价值。“四季红”的主要繁殖方法有播种繁殖、扦插繁殖和嫁接繁殖[2]，但是红枫种子繁殖方式成活率较低，一般在30%～40%[3-4]，而扦插繁殖与嫁接繁殖效率受母树年龄与环境因素影响较大。组织培养不仅可以克服种子繁殖中存在的诸多问题，而且可以克服扦插繁殖速度慢、难生根、繁殖率低的缺点，还能保持母体的遗传特性，是解决优良种苗快速繁殖的最佳方式。但是笔者观察到红枫“四季红”品种的休眠芽不仅萌动较慢，而且只有部分能够展叶，其他多数休眠芽一直停留在休眠状态，因此如果要建立该品种的离体快速繁殖体系，必须解决外植体材料来源困难的问题。为获得足够多的用于离体培养的外植体材料，本研究分别在活体条件和离体条件下外施植物激素，探讨植物激素对红枫休眠芽萌发的影响。

1材料与方法

1.1试验材料

研究材料为南京桥林林业科技有限公司的红枫“四季红”品种的嫁接盆栽苗，地径为3cm，苗高1m，休眠芽均处于休眠状态。

1.2试验方法

1.2.1活体条件下赤霉素对茎段休眠芽萌发的影响“四季红”红枫原种购自加拿大，目前在市场上出现得很少，国内只有少数公司进行培育，市场供不应求。本试验中用到的材料为嫁接再生植株，由于嫁接难度大因而材料稀少，因此，本试验选取24株嫁接盆栽苗，进行不同浓度（0、0.05、0.10 mg/L）的赤霉素处理，每组8株。每隔3 d喷施1次，共处理9次，27 d后统计休眠芽萌发个数。

1.2.2离体条件下TDZ和NAA对休眠芽萌发的影响

1.2.2.1外植体灭菌处理从未经GA处理的植株上剪下带有休眠芽的茎段，每个茎段长约4 cm，分别标号，用于后期组织培养。剪取材料时用镊子夹取，再放入收纳袋，避免手指上的油脂触碰到茎段，难以表面灭菌，造成后期组培污染。

在灭菌处理之前，先用自来水冲洗20 min，并用毛刷轻轻刷去上面的杂质，然后设计不同灭菌方式。消毒处理采用3因子2水平的L4（23）正交试验设计，分别利用70%乙醇（10、15 s）、吐温80（加2滴、不加）和0.1% HgCl2（10、15 min）进行处理。各处理后均用无菌水冲洗5遍，均处理30个外植体，25 d后统计污染率和萌发率，筛选出最佳灭菌方式。

1.2.2.2培养基的设计本试验根据报道的美国红枫组培方法[5-6]，以MS+1.0 mg/L BA为基础，分别测定TDZ和NAA对休眠芽萌发的影响。生长调节剂的浓度和种类采用2因素3水平L9（32）正交试验设计（表1），其中TDZ的浓度分别为 0、0.5、1.0 mg/L，NAA的浓度分别为0.50、0.75、1.00 mg/L。

培养基中蔗糖30 g/L、琼脂6.4 g/L，pH值为5.7，分装至三角瓶中后于121 ℃高压灭菌20 min。每瓶接种1个外植体，每个处理接10瓶，3次重复。接种后每天观察休眠芽的萌动趋势，25 d后统计接种数（除去污染数）、萌芽率并观察芽的长势，寻找最合适的培养基。培养期间及时随机取出污染的瓶子，以避免交叉污染，因此统计的接种数为去除污染数后的总数。

1.2.2.3培养环境培养材料于（25±2） ℃光培养16 h，暗培养8 h，在相对湿度50%～70%的环境下进行培养，每25 d继代培养1次。

1.2.2.4数据分析方法培养25 d后统计各个处理的污染率、萌芽率等指标。指标计算方法如下：污染率=（污染的休眠芽数目/接种的休眠芽数目）×100%；萌芽率=（未污染休眠芽萌动数目/未污染的休眠芽数目）×100%。

用Excel软件计算在活体条件下试验组和对照组数据的显著性，用SPSS软件分析离体条件下最佳组合培养基。

2结果与分析

2.1赤霉素处理对茎段休眠芽萌发的影响

根据不同处理条件下休眠芽萌发情况（图1），休眠芽的萌发率随着所施GA浓度升高而升高。当赤霉素浓度为 0.10 mg/L 时，萌发率最高，平均每天萌发2个休眠芽，27 d后，平均每株萌发数达到20个（图2-C）；赤霉素浓度为 0.05 mg/L 时，平均每天萌发1个休眠芽，27 d后，平均每株萌发数达到12个（图2-B）；而对照组平均每6 d左右萌发1个休眠芽，27 d后只有顶部枝条发芽，平均每株萌发8个（图2-A）。经GA处理后，休眠芽萌发时间提前，在处理3 d后，休眠芽开始萌发，而对照组则在处理6 d后开始萌发。将处理27 d后各组休眠芽萌发个数用Excel进行显著性分析可以得出，P值为0.043<0.05，说明赤霉素对休眠芽萌发促进效果显著，浓度为0.10 mg/L时萌发效果最好。

2.2离体条件下休眠芽萌发培养

2.2.1不同消毒方式的影响选择适当的消毒剂组合并确定合适的消毒时间是建立外植体无菌体系的重要基础。本试验对“四季红”红枫带芽茎段用70%乙醇表面消毒20～30 s，无菌水冲洗5次，然后用0.1%HgCl2灭菌5～7 min（加或不加吐温80）进行表面灭菌，用无菌水冲洗5次后，接种到休眠芽萌发培养基上，消毒剂组合效果见表2。

方差分析结果表明，根据污染率试验结果，吐温80对外植体灭菌效果影响最大，其次是0.1% HgCl2灭菌时间，最后是乙醇灭菌时间。综合污染率及萌发率试验结果，A2B1C1为最优组合，即乙醇处理30 s，含吐温80的0.1%HgCl2灭菌 5 min，该处理条件下污染率为4.60%，与其他处理差异极显著（P<0.01）。吐温80可增加灭菌液的溶解度，使消毒液能充分与植物材料接触，不会造成材料的损伤，数据结果表明，吐温并未对萌发率造成干扰。

2.2.3离体培养条件下TDZ和NAA对休眠芽萌发的影响由表3可以看出，不同生长调节剂及配比对休眠芽的萌发效果存在一定的差异。当浓度为0.5 mg/L TDZ与不同浓度NAA配比时，萌发率最好。如表3所示，1.00 mg/L NAA和0.5 mg/L TDZ组合为正交试验最佳组合，休眠芽的萌发率最高，萌发率为73.3%，而且萌发状态较好，在接种培养10 d后芽苞膨大（图3-B），随后开始慢慢展叶，20 d后展出新叶（图3-C），30 d后基于稳定，35 d后完全展叶，叶柄长约1 cm（图3-D）。其次，0.75 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ，萌发率为66.7%；最后为0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L TDZ，萌发率为66.7%。当TDZ浓度提高到1.0 mg/L时，萌发率明显下降，0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L TDZ萌发率为20%，0.75 mg/L NAA +0.5 mg/L TDZ萌发率为40%，1.00 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ萌发率为60%。由此看出，在相同浓度TDZ条件下休眠芽萌发率随NAA浓度升高而升高。同时，试验结果表明当TDZ浓度高于0.5 mg/L时，茎段底部玻璃化现象的频率增加，玻璃化程度加重将抑制植物的生长，萌发率开始下降。这与谢寅峰等的青钱柳休眠芽萌发诱导研究结果[7]一致。

3结论与讨论

赤霉素是一种高效广普性植物激素，赤霉素处理会促进植物可溶性糖和蛋白质的合成，促进植物细胞及茎段伸长、叶片扩大，加速生长和发育，使作物提早成熟[8]。薛志成用 5～10 mg/L赤霉素溶液处理15 min，有利于马铃薯休眠芽的萌发[9]。本研究首次对“四季红”红枫休眠芽喷施赤霉素，探讨外源激素对休眠芽萌发的影响，在3组试验中，对照组萌发率明显低于试验组，说明赤霉素有利于“四季红”红枫休眠芽的萌发，而且萌发速率随着浓度的升高而升高。结果显示，当赤霉素浓度为0.10 mg/L时，休眠芽萌发效率最佳。

外源植物激素对外植体的形态建成及其调控起着十分重要的作用，其种类的选择和浓度的搭配影响着植株的再生方式。TDZ是科学家们发现的具有植物细胞分裂素活性的一类生长调节物质，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眠，并且可以通过配合其他植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程[10-13]。Hutchison等利用热带果树的带腋芽茎段为外植体，在培养基中添加TDZ，已成功诱导腋芽萌发[14-16]。本试验参考美国红枫MS+1.0 mg/L BA的培养条件，在培养基中添加不同浓度的TDZ和NAA，结果显示，当添加0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L NAA时，能快速有效的促进休眠芽萌发。

本试验分别在自然条件和离体条件下，初步探讨了四季红红枫休眠芽萌发的影响因子，通过调整外源激素的浓度，达到休眠芽快速萌发的效果，为稳定而高效的组织培养与快繁技术体系的建立奠定了基础。

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