天然反义转录物及其在神经胶质瘤中的功能

朱丽媛，彭小忠

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院，生物化学与分子生物学系/医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

天然反义转录物及其在神经胶质瘤中的功能

朱丽媛，彭小忠Δ

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院，生物化学与分子生物学系/医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)

天然反义转录物(natural antisense transcripts，NATs)被定义为在自然状态下生物体内产生的内源性RNA，其通常是通过与靶分子进行序列互补而形成天然的正义-反义转录物配对的双链RNA。NATs普遍存在于原核和真核生物中，可以在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个层次经由不同机制调节基因的表达。此外，NATs也与恶性肿瘤的发生发展密切相关，一些NATs在正常组织与神经胶质瘤组织中的表达存在显著差异。NATs可能成为神经胶质瘤诊断、预后以及治疗效果的一种新的标志物，同时NATs也是潜在的新的胶质瘤基因治疗的靶点。本文对NATs的分类及其在神经胶质瘤中的功能及可能的机制做具体阐述。

天然反义转录物(NATs)；神经胶质瘤；癌症

1 天然反义转录物的生物学本质

1.1 NATs的定义 反义RNA(antisense RNA，AS-RNA)指的是与特定DNA或RNA互补结合的转录本，是自然条件下存在于生物体内的一类与靶标转录本转录方向相反、序列互补的内源性RNA分子，可与正义靶RNA通过碱基互补配对方式形成双链RNA(double strand RNA，dsRNA)发挥功能。1977年Timmons等[1]利用寡核苷酸合成的方法合成了AS-RNA，但此后发现天然反义转录物(natural antisense transcripts，NATs)广泛存在于原核和真核生物中，并能以非编码RNA的形式发挥作用[2-4]。事实上，人源和鼠源NATs分别占各自整个基因组的约22%和29%[5]。值得注意的是，NATs可以是蛋白编码基因，也可以是非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，据统计，在人类基因组中这种正义-反义配对转录本最普遍的存在形式是正义蛋白编码基因-反义ncRNA组合[6]。现如今，关于NATs的鉴定有多种方法，例如基因表达的连续分析、cDNA序列分析、Northern杂交、链特异性逆转录PCR、电子杂交、基因芯片等技术。NATs作为一种丰富的生物分子资源，在生命过程中具有重要的调控功能。

1.2 NATs的分类 根据NAT对其靶基因作用部位的不同，可以分为顺式NAT(cis-NAT)和反式NAT(Trans-NAT)[7]。cis-NATs的转录起源于靶基因基因座位的负链DNA，即来自基因组同一位点相反链上的转录；而trans-NATs转录自与靶基因不同的基因座位。cis-NAT通常情况下与靶基因重叠且序列完全互补，可以相对特异地调控正义靶基因的表达；trans-NAT作用于不同基因座位序列不完全互补的靶基因，并可以作用于多个不同正义转录物，形成复杂的调控网络[8]。

根据NATs与靶基因的重叠位点和程度，cis-NAT主要分为头对头重叠、尾对尾重叠和完全重叠这3种形式。头对头(head to head，5’-5’)重叠是指NATs的5’端序列与正义靶基因5’端序列互补(包括5’UTR区、外显子和内含子)；尾对尾(tail to tail，3’-3’)重叠是指配对正义和反义转录本3’端序列互补(包括3’UTR区、外显子和内含子)，尾对尾重叠是最普遍存在的顺式NAT。以上2种均属于不完全重叠形式；而完全重叠方式是指反义NAT与正义靶基因序列完全互补[5]；此外近来研究还发现有非重叠NATs[9-10]。

根据配对转录本互补区域的编码性质，发生序列重叠的转录本可以是2个蛋白编码基因、1个蛋白编码基因和1个ncRNA，或者2个都是ncRNAs。因此NATs可以分为编码-编码、编码-非编码和非编码-非编码3类形式。在人类基因组中，最普遍存在的形式为反义RNA是ncRNA，正义RNA是蛋白编码基因的NAT配对组合，其约占全部正/反义基因对(sense/antisense pair) 的50%[5]。

根据NATs转录本片段长度不同，NATs可分为短链NATs和长链NATs。以200核苷酸(nucleotide，nt)为界，长度超过200 nt的NATs被称为长链NATs或反义LncRNA；短于200 nt的NATs被称为短链NATs。长链NATs在结构上与mRNA具有一些相似特点，如具有5’帽子结构等；但也有不同之处，譬如：有些长链NATs的3’端不具有多聚腺苷酸尾巴；长链NATs被发现也可以定位于核内[11]。修饰方式和亚细胞定位的不同决定了其可以通过不同的机制来调控正义靶基因表达。

1.3 NATs在神经系统的调控作用 在真核生物中，NATs广泛参与了基因组印记、RNA干扰、翻译水平调节、选择性可变剪接、X染色体失活和RNA编辑等多种调控过程。NATs在真核细胞中可以表达在胞核，也可以在胞浆，其介导的调控可发生在基因表达从转录到翻译的任何环节[12]，可以在转录、RNA/蛋白加工或核质转运等不同水平调节靶基因的表达[13]。

NATs在生物体内普遍存在，在哺乳动物神经系统的表达尤为丰富，其对神经系统正常生理功能有重要调节作用。首先，许多NATs是中枢神经系统特异表达，因此NATs会参与脑皮质发育和髓鞘形成，在神经元形成过程，如神经干细胞(NSCs)自我更新和分化中起重要调节作用[14]。脑源性神经营养因子(BDNF)在中枢神经系统的发育过程中发挥重要作用，BDNF-AS为保守的反义lncRNA，通过抑制BDNF-AS，可提升BDNF的表达从而诱导神经元生长和分化[15-16]。此外，NATs还可以参与到神经元突触形成和可塑性调控，神经颗粒素(NRGN)在大脑皮层、海马和纹状体神经元胞体和树突中呈高表达，调控突触后信号转导通路，可以降低在记忆强化早期调控因子CaMK II的活性。NATs也参与离子通道和神经元兴奋性调控，如最近研究显示从大鼠背根神经节(DRG)初级感觉神经元中发现了钾离子通道Kcna2 RNA互补的反义RNA[17]，Kcna2-AS参与调控神经病理疼痛的诱导和维持过程。

鉴于NATs在中枢神经系统的重要生理性调控作用，其异常改变可能导致神经系统疾病，随着NATs功能研究的深入，其很可能作为神经系统疾病诊断的新型生物学标志物或潜在的治疗靶点。目前来讲，NATs在神经系统疾病的研究主要集中在神经变性病，如阿尔茨海默病[18]、帕金森病[19]和亨廷顿病[20]等，NATs通过参与调控基因表达及一些重要信号转导通路来介导这些疾病的发生和发展，后续对NATs分子机制的研究将有助于人们更好地理解神经系统疾病的发病机理，为治疗疾病提供新的理论基础和潜在的药物靶点。

2 原癌性NATs在神经胶质瘤中的功能

在肿瘤中，大部分基因组发生了表观遗传改变如去甲基化，转录噪音增加可能引起反义转录物的转录产生，进而调控关键抑癌基因功能，最终导致肿瘤恶性转化。有统计阐明，反义转录物在肿瘤中所占的比例比正义转录物更高[16]，说明反义转录物在肿瘤发生发展中所起到的功能是极其重要的。最新研究表明，NATs在组织中的差异表达与人类肿瘤的发生发展过程密切相关，因此，NAT的异常表达成为肿瘤研究中的重要考虑因素。目前已经证实αHIF[21]、survivin[22]、gfg-1[23]、p15AS[24]、rTSα等NAT分子能够直接作用于多种不同肿瘤相关的关键基因，NATs与靶基因异常表达导致了肿瘤的发生、发展。

中枢神经系统脑胶质瘤(glioma)约占原发性颅内肿瘤的40%～50%，是中枢神经系统中最常见的肿瘤。对于神经胶质瘤，传统的治疗手段包括手术治疗、放疗和化疗。由于胶质瘤呈浸润性生长，肿瘤组织与周围正常脑组织界限不清，手术难以全切，效果不佳，复发率高。肿瘤细胞产生的放化疗抵抗造成放疗和化疗效果的降低，过度的放化疗容易对中枢神经系统产生毒性作用，因此神经胶质瘤的治疗效果及预后均较差。探索胶质瘤治疗的新途径，尤其是从基因水平阐明胶质瘤的发生、发展和演变机理，寻找有效的基因治疗的靶点是神经外科研究的热点，也是有效治疗胶质瘤亟待解决的艰巨任务。

近几年的相关研究表明，NATs在胶质瘤的生长、增殖以及迁移侵袭等过程中具有重要调控功能。肿瘤抑制基因p15是一种与白血病有关的周期素依赖性蛋白激酶抑制剂，在p15基因座位上转录生成的反义RNA p15AS表达水平正好与p15相反，即在p15高表达的组织或细胞中，p15-AS表达水平下调；并且在调控机制方面，p15AS是通过形成异染色质而非DNA的甲基化来导致p15基因表达沉默的[24]。TSLC1作为肿瘤抑制基因，通常在许多肿瘤中被甲基化下调，包括神经胶质瘤、神经母细胞瘤、肺癌、鼻咽肿瘤、恶性黑色素瘤、食管癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、大肠癌、子宫颈癌和前列腺癌。而TSLC1的反义转录本TSLC1-AS1作为lncRNA家族成员之一，可以促进TSLC1的表达，从而抑制肿瘤的增殖、迁移能力，反之亦然[25]。可见，NATs在调控胶质瘤发生发展过程中起到重要的功能。

反义核酸技术是基因治疗中比较有特色的方法之一。在设计并实施这项技术时，首先针对在肿瘤发生发展进程中起重要作用的经典癌基因或抑癌基因的突变体以及自分泌生长因子及其受体基因，设计出其反义核酸序列；之后根据序列进行合成并注入体内，以此在转录或翻译水平抑制或下调异常基因的表达，达到阻断肿瘤细胞内异常信号传导的目的，使肿瘤细胞通过被抑制生长或诱导凋亡转入正常轨道。目前临床上已经针对胶质瘤发生发展起重要作用的癌基因(如c-myb[26]，c-myc[27])，用反义核酸来封闭以达到治疗的目的。自分泌生长因子及其受体的反义封闭在胶质瘤治疗中也有重要作用。目前已经成熟的有bFGF[28]、TGF-β2[29]、VEGF[30]反义RNA等有效治疗方法。后续基因治疗靶点的筛选研究会更加丰富反义核酸治疗技术。天然反义转录物治疗胶质瘤的前景比较广泛，可以将其与多种生物治疗以及传统的放疗和化疗密切结合，可能会为胶质瘤治疗带来新的生机。

3 NATs的调控机制和调控网络

3.1 NATs调控基因表达的分子机制 真核生物中基因表达调控及细胞信号传导是极为复杂精密的网络，迄今为止，NATs在这一网络中参与的调控机制主要有转录干扰、RNA封闭、依赖双链RNA机制和反义诱导的甲基化(染色质重建和修饰)等[16]。在具体的调控过程中，NATs可以直接以cis-或者trans-的方式与正义靶基因通过碱基互补配对发挥作用, 也可通过影响靶基因的转录、突变、RNA/蛋白运输和翻译等过程中的靶点来影响基因表达[31-32]。NATs对靶基因表达的调控作用是以互补结合成双链配对RNAs为前提的，通过RNA编辑[33]、RNA干扰[34]、RNA封闭[35]和转录干扰[36]等方式来实现。NATs启动子区会结合一些经典的核心转录因子[37]，在某种生理刺激下，这些NATs和他们相应的正义靶基因可能发生竞争结合相同的转录因子，提示NATs和他们的正义靶基因可以在特定细胞或组织中共表达或成反比表达[38]。此外，NATs与DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学调控之间也存在直接的联系[39]。

随着后基因组和功能基因组的研究逐渐深入，用系统的科学实验技术和生物信息学分析来阐明NAT真正的生物学意义，可以为理解人类反义RNA(antisense RNA，AS)的特性提供新的认识，有关NATs新的作用分子机制的发现甚至可以为了解人类多种疾病的发生发展进程提供新的视角和科学依据。

3.2 基因、NATs和microRNAs构成的调控网络 NATs，siRNA和microRNAs在作用机制上都是通过序列互补与靶分子结合形成双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)来调节靶基因的表达。但是，NATs生成后可以直接与靶基因结合影响其表达；并且NATs的作用机制有好多种，靶点包括mRNA和蛋白质分子；NATs除了对靶基因产生抑制效应，还可以促进靶基因的表达；如果说microRNA主要微调细胞的分化和生物体组织的生长发育过程，siRNA是作为一种生物自身的基因免疫机制，那么NATs主要是调控对维持生物体正常生理功能有重要作用的关键基因的表达，NATs对个体生命活动的调控更加普遍和深入。

众所周知，microRNA是一类单链小非编码RNA，长约22nt，通常情况下通过与靶mRNA的5’或3’ UTR完全或不完全互补结合，引起mRNA的降解或翻译抑制。而在特定情况下，NATs可以与正义靶基因配对结合，通过封闭microRNA在同一靶基因上的结合位点来增加mRNA半衰期，维持正义转录物的稳定性，延长其RNA活性。例如，BACE1-AS可以在胞浆中通过封闭miR-485-5p的作用靶点维持BACE1 mRNA的稳定性[18]。microRNA也可以通过反义lncRNA来间接影响mRNA的功能，如，小脑退化相关蛋白1(CDR1)，其NAT形式是一种选择性剪接后的非线性环形外显子RNA，可以通过直接结合来增加CDR1 mRNA的稳定性，核内miR-671依赖Ago来降解CDR1-AS从而使其表达下调，伴随CDR1 mRNA表达的减少[40]。因此，NATs不仅作为重要的调控因子来影响整个基因表达的生命过程，而且可以与microRNA和靶基因等分子构成作用网络，在整个调控环路中发挥不可或缺的功能。

4 结语

目前已知真核生物多个物种中都存在NATs的广泛表达，并且NATs对生物的组织生长发育和相关疾病的发生发展有重要的调控作用。各个物种基因组和转录组的分析为NATs的研究提供了充足的原始数据。后续对NATs的研究应更多地放在其自身表达调控机制中，随着CAGE(cap analysis of gene expression)技术的出现，更多NATs被发现其转录的原始位置。NATs本身的表达也存在时空差异，具有不同模式，表明其是受其它调控因子的严格调控。对于NATs上游以及下游因子的功能及机制探索对未来的生命科学领域乃至医学临床领域都将是重大的突破，从而鉴定出新的诊断标记和药物靶标。

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(编校：吴茜)

Natural antisense transcripts and the functional role in gliomagenesis

ZHU Li-yuan, PENG Xiao-zhongΔ

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology; Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)

Natural antisense transcripts (NATs) are reverse-complementary at least in part to the sequences of other endogenous sense transcripts and regulate the expression of their target genes. NATs, considered until recently as transcriptional noise, are a very common phenomenon in human and eukaryotic transcriptomes. Otherwise, they play an indispensible functional role in organ formation, cell differentiation, diseases and pathology. NATs have been shown to regulate nearly every level of gene regulation: pre-transcriptional, transcriptional and post-transcriptional, through DNA-RNA, RNA-RNA or protein-RNA interactions. Glioma is a kind of brain tumor with high incidence and lethality. Recently, it had been reported the profile of NATs in glioma and indicate many NATs which were dysregulated. The roles of NATs in gliomagenesis were primarily characterized and we discovered some significant findings about maker molecules. In this review, we summarized the research on the function of oncogenic NATs in glioma and made some detail for mechanism.

natural antisense transcripts (NATs); glioma;cancer

国家自然科学基金(31301151)

朱丽媛，女，博士在读，研究方向：NAT参与胶质瘤发生发展，E-mail：zly_smile@126.com；彭小忠，通信作者，男，博士，教授，研究方向：神经系统发育和疾病分子机制，E-mail：pengxiaozhong@pumc.edu.cn。

R982

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.01