重症监护病房耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性分析

潘慧琼, 袁雪峰, 周　敏, 厉晓玲, 李露池

(长沙市第一医院, 湖南 长沙　410005)



重症监护病房耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性分析

潘慧琼, 袁雪峰, 周敏, 厉晓玲, 李露池

(长沙市第一医院, 湖南 长沙410005)

[摘要]目的了解重症监护病房(ICU)分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的药敏结果及同源性。方法对2014年4—5月某院ICU患者和环境分离的11株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行药敏试验，以及采用随机扩增多态性DNA(RAPD)扩增法进行同源性分析。结果11株肺炎克雷伯菌8株分离自患者，3株分离自环境，标本分布以痰为主(6株，占54.55%)。药敏试验结果显示：10株(90.91%)对环丙沙星耐药；11株对复方磺胺甲口恶唑均敏感，对亚胺培南均为中介，对其余抗菌药物耐药率均为100%。11株肺炎克雷伯菌均有3个条带，可以分为2型：Ⅰ型10株(1～5号、7～11号菌株)，Ⅱ型1株(6号菌株)。结论医院ICU肺炎克雷伯菌耐药严重，ICU患者和环境分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌为同一克隆株。加强ICU环境清洁、消毒及监测，有利于减少和及时预警多重耐药菌，降低医院感染。

[关键词]肺炎克雷伯菌; 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌; 同源性; 重症监护病房; 医院感染

[Chin Infect Control，2015，14(12)：827-829]

医院重症监护病房(intensive care unit,ICU)是救治危重患者的场所，患者常进行各种侵入性操作，接受大量抗菌药物治疗，伴有严重基础疾病，免疫功能低下，常导致医院感染的发生，成为多重耐药菌产生和传播的高发区域。肺炎克雷伯菌是最常见的医院感染病原菌，可引起下呼吸道、泌尿生殖道、血液、伤口及颅内等部位感染。随着碳青霉烯类抗生素的大量使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌逐渐增多[1]，已成为全球性问题，ICU多重耐药菌管理面临着严峻挑战。本研究对某一时间段内某院ICU患者和环境分离的11株肺炎克雷伯菌进行药敏检测和同源性分析，探讨多重耐药菌感染患者病房环境消毒和环境监测的必要性。

1材料与方法

1.1菌株来源收集2014年4—5月某院ICU患者和环境分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌。

1.2仪器与试剂主要包括Vitek-32型全自动微生物分析仪及配套鉴定卡(法国生物梅里埃公司)、Real-Time PCR(美国Applied Biosystems)、DYY-ll型电泳仪(北京君意东方设备有限公司)、数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)、DNA提取试剂盒(北京天根生物科技有限公司)、琼脂糖(GENE COMPANY LED)。

1.3菌株鉴定及药敏试验细菌鉴定采用法国生物梅里埃公司ATB细菌鉴定仪和相应的鉴定卡。抗菌药物敏感试验为微量肉汤法，按美国临床实验室标准化协会(CLSI)2012年版标准操作及判断结果，抗菌药物包括哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、头孢噻吩、头孢拉啶、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢西丁、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、环丙沙星、复方磺胺甲口恶唑。

1.4同源性分析DNA的提取：取-20℃保存的肺炎克雷伯菌菌种接种于血平板，转种3次，挑取单个菌落接种于肉汤培养基。取3 mL培养液，离心后采用缓冲液和蛋白酶K处理，吸附柱进行过滤，用洗脱液对吸附柱进行洗脱，12 000 r/min离心3 min，提取DNA置-20℃保存。基因同源性分析：采用随机扩增多态性DNA(RAPD)扩增DNA模板,引物序列为(5’-3’):5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3[2]，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。总反应体系25 μL：7.5 μL灭菌双蒸水，12.5 μL 2×Master MIX，2 μL引物ERIC 2，模板3 μL。RAPD反应条件[2]：94℃预变性1 min，94℃变性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35个循环，72℃最后延伸5 min。将RAPD产物置于2%的琼脂糖凝胶中进行电泳；每孔加DNA产物7 μL。电泳条件为电压70 V，电流60 mA，时间120 min。

1.5DNA同源性判定标准DNA条带位置完全相同者，为同一型；相差一条者，密切相关，为亚型；不满足上述条件者为不同基因型[2]。

2结果

2.1一般资料2014年4—5月该院ICU共检出耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌11株，其中8株来源于ICU患者送检标本， 3株来源于ICU环境采样。标本分布为痰(6株)，清洁后呼吸机出口(2株)，血、分泌物、呼吸机面板各1株。

2.2药敏结果11株肺炎克雷伯菌对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、头孢噻吩、头孢拉啶、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢西丁、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、奈替米星均100%耐药；对复方磺胺甲口恶唑均敏感,对亚胺培南均为中介。10株对环丙沙星耐药，耐药率90.91%。

2.3细菌同源性鉴定电泳结果显示，11株肺炎克雷伯菌均有3个条带，可以分为2型：Ⅰ型10株(1～5号、7～11号菌株)，Ⅱ型1株(6号菌株)。见图1。

M: marker;1—11泳道：11株碳青霉烯类肺炎克雷伯菌标本;N:阴性对照

图1 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌RAPD电泳图

Figure 1RAPD electrophoresis map of CRKP

3讨论

肺炎克雷伯菌作为一种条件致病菌所导致的感染在细菌感染学疾病中的所占比重日渐增加，Amazian等[3]对地中海地区27所医院调查显示，肺炎克雷伯菌占医院感染的9.20%；我国肺炎克雷伯菌是医院感染的主要致病菌之一，占9.03%[4]。随着β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类和碳青霉烯类等抗菌药物的广泛使用，多重耐药菌迅速出现，多重耐药菌的分离率逐年上升。同一克隆株在医院内的播散容易导致多重耐药菌的暴发流行，国外曾报道一起因多重耐药肺炎克雷伯菌引起的医院感染暴发流行，感染患者病死率高达40%[5]。

预防与控制多重耐药菌的传播和流行是迫切需要解决的问题。菌株基因同源性分析对医院感染暴发流行的来源，以及传播途径的追踪具有重要意义。常用的同源性分析方法有质粒指纹图谱分析、限制性核酸内切酶分析、RAPD、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、重复序列分析[6-7]。RAPD具有快速、简便、经济的特点，有助于查找医院感染源，切断感染途径，是一种值得推广的方法。

本研究药敏试验结果显示，11株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药谱基本相同，对大部分抗菌药物均耐药，说明医院ICU肺炎克雷伯菌耐药严重，药敏结果相同表明菌株可能来自同一个克隆株。基因同源性分析显示，除6号痰标本分离株外，其余7株临床分离株与3株环境标本分离株基因型相同，证实10株菌均来自同一克隆菌株。药敏和基因分析结果表明，肺炎克雷伯菌能从患者扩散到周围环境，并且在环境中存活，潜在可能通过环境途径进行传播，导致肺炎克雷伯菌在ICU内传播。因此，有必要加强对环境的清洁与消毒，减少环境中多重耐药菌；定期对环境卫生进行采样分析，对环境消毒效果进行评价；对多重耐药菌的暴发进行预警，有效降低多重耐药菌在ICU内的传播。研究[8]报道，加强环境监测，使其卫生清洁质量保持在较高水平，可有效防控ICU多重耐药菌医院感染，降低医院感染发病率。

多重耐药菌感染增加患者疾病的治疗难度，影响抢救成功率和预后。环境因素作为外源性危险因素应重点控制，通过对环境进行及时的清洁与消毒，有效避免了因交叉感染造成的耐药菌株传播，对遏止医院感染的蔓延能发挥重要作用。通过采取有效的消毒隔离措施，可最大程度减少医院感染的发生。常规环境卫生学检测是对消毒效果的监测，针对性检测是有重点的过程监控，有利于找出工作中的薄弱环节或存在的隐患，是防止医院感染暴发流行有效的监测方式。

[参 考 文 献]

[1]肖素香.外科重症监护病房医院感染原因分析及预防对策[J].中华医院感染学杂志, 2008, 18(2):178-180.

[2]Bou G, Cerveró G, Domínguez MA,et al. Characterization of a nosocomial outbreak caused by a multiresistantAcinetobacterbaumanniistrain with a carbapenem-hydrolyzing enzyme; high-level carbapenem resistance inA.baumanniiis not due solely to the presence of beta-lactamases[J].J Clin Microbiol, 2000, 38: 3299-3305.

[3]Amazian K, Rossello J, Castella A, et al. Prevalence of nosocomial infections in 27 hospitals in the Mediterranean region[J]. East Mediterr Health, 2010, 16(10)：1070-1078.

[4]文细毛, 任南, 吴安华, 等.全国医院感染监控网医院感染病原菌分布及变化趋势[J].中华医院感染学杂志, 2011, 21(2):350-355.

[5]Lithgow AE, Kilalang C. Outbreak of nosocomial sepsis in the Special Care Nursery at Port Moreshy General Hospital due to multiresistantKlebsiellapneumoniae: high impact on mortality[J]. P N G Med J, 2009, 52(1-2):28.

[6]Bergeron MG, Oullette M. Preventing antibiotic resistanceusing rapid DNA-based diagnostic tests[J]. Infect Control Hosp Epidemiol,1998,19(8):560-564.

[7]李丹, 吴安华, 冯丽, 等.重症监护室患者与环境分离的多重耐药不动杆菌属细菌同源性研究[J].中国感染控制杂志, 2008, 7(5):306-309.

[8]陈惠清, 林晨曦, 周春莲.环境卫生质量对预防ICU多重耐药菌医院感染作用的研究[J].中国消毒学杂志, 2014, 31(5):493-497.

(本文编辑：陈玉华)

·论著·

Homology of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaein an intensive care unit

PANHui-qiong，YUANXue-feng，ZHOUMin，LIXiao-ling，LILu-chi(TheFirstHospitalofChangsha,Changsha410005,China)

[Abstract]ObjectiveTo understand antimicrobial resistance and homology of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) from an intensive care unit (ICU).Methods11 CRKP isolates from patients and environment of an ICU in a hospital were performed antimicrobial susceptibility testing, the homology of CRKP was analyzed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method.ResultsOf 11 CRKP isolates, 8 were from patients, and 3 from environment, the main specimen was sputum(n=6, 54.55%). Antimicrobial susceptibility testing results revealed that 10 (90.91%) CRKP isolates were resistant to ciprofloxacin; 11 isolates were susceptible to compound sulfamethoxazole, intermediate to imipenem, and resistant to other antimicrobial agents(100%). All 11 CRKP isolates had 3 bands, and were divided into two types: (type Ⅰ, n=10; type Ⅱ, n=1).ConclusionAntimicrobial resistance of Klebsiella pneumoniae in ICU is serious, CRKP isolated from ICU patients and environment are of the same clone. Cleaning, disinfection, and monitoring of ICU environment should be strengthened, which is helpful for reducing, timely warning of multidrug-resistant organisms, and reducing healthcare-associated infection.

[Key words]Klebsiella pneumoniae; carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae; homology; intensive care unit; healthcare-associated infection

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2015.12.011

[通信作者]王莉E-mail: toto-86@163.com

[作者简介]王莉(1977-)，女(汉族)，江苏省东台市人，副主任医师，主要从事医院感染研究。

[基金项目]湖北省预防医学会“消毒领域科研创新”(XKC2015-06)

[收稿日期]2015-05-22

[中图分类号]R181.3+2R378

[文献标识码]A

[文章编号]1671-9638(2015)12-0827-03