多囊卵巢综合征生物样本库建设及管理

王丽萍，张晓梅，吕芳，潘宇，李雪丽，何笑，鲁军，潘云龙



多囊卵巢综合征生物样本库建设及管理

王丽萍，张晓梅，吕芳，潘宇，李雪丽，何笑，鲁军，潘云龙

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄女性最常见的一种生殖内分泌疾病，影响世界 5% ~ 10% 的育龄妇女[1]，其临床表现呈多态性，包括月经紊乱或稀发、闭经，多毛和肥胖，伴卵巢多囊性增大等。PCOS 与不孕和肥胖有关，可增加患 II 型糖尿病、胰岛素抵抗、高血压、氧化应激、血脂异常和心血管等疾病的终身风险[2]，PCOS 的研究已经取得了很大的进展，但是发病机制至今不明，目前认为是环境[3]和遗传因素[4]的共同作用的结果。PCOS 基因组研究揭示异常基因改变参与多方面生物过程，主要包括细胞分化[5]、细胞增生[6]、细胞凋亡[7-8]、基因[9]及蛋白表达[10]等。明确多囊卵巢综合征发生发展的机制、个性化治疗方案、疗效的随访、药物敏感性研究及新药研发等离不开大量的生物样本，因此，江苏省苏北人民医院建立了高质量、标准化、规范化、信息化的多囊卵巢综合征生物样本库。

生物样本库又称生物银行（biobank），主要是指标准化收集、处理、储存和应用健康和疾病生物体的生物大分子、细胞、组织和器官等样本，包括人体器官组织、全血、血浆、血清、生物体液或经处理过的生物样本（DNA、RNA、蛋白等）以及与这些生物样本相关的临床、病理、治疗、随访、知情同意等资料及其质量控制、信息管理与应用的系统。我院生物样本库规划为样本处理区和样本存储区，目前存储设备可满足 40 万 ~ 50 万份大规模科研样本存储需求，希望能够为多囊卵巢综合征早期干预、抑制疾病发展提供强有力的支持。

1 材料与方法

1.1 组织架构

我院生物样本库设有管理委员会、学术委员会及伦理委员会，由专职人员负责管理。

1.2 环境设施

生物样本库占地面积约 400 m2，设有标本取材室、体液处理室、组织处理室、核酸提取室、资料室及低温存储室。主要设备有–196 ℃液氮罐（Taylor-wharton）、–86 ℃超低温冰箱（Thermo）及室温石蜡切片柜、24 h 温控系统（Haier）、4 ℃低温离心机（Thermo）、制冰机（Panasonic）、低温条码打印机（Brady）、石蜡切片机（Leica）、冰冻切片机（Thermo）、全自动封片染片机（Sakura）、超微量分光光度计（Thermo）、凝胶成像系统（Bio-Rad）等。

1.3 信息系统

采用无锡唐颐生物样本库智能信息管理系统，可根据临床资料个性化设置需求模块。液氮罐、冰箱、石蜡柜均实现可视化存储，能够与院内 HIS、LIS、PACS 接口对接，实时获取临床资料。贝迪打印机、扫码机、条码采用低温二维码打印并于标签显示其样本编码、采集日期、类型、存储方式以及存储位置等。例如，PC-1600720-BS-F-02，代表多囊卵巢综合征，2016 年第 720 号入库，血清，冰冻存储，第二复份。

1.4 流程管理

按照中国医药生物技术协会生物样本库标准[11]、国际生物和环境样本库协会（ISBER）样本库管理规范[12]，结合我院实际情况制定生物样本库制度职责及标准操作流程（SOPs），其中包括人员管理、仪器设备管理、实验管理、医院感染管理、档案管理，样本采集、处理、存储、质量控制、运输流程、销毁管理等。

多囊卵巢综合征生物样本库的建立已通过江苏省苏北人民医院伦理委员会审核，具体采集计划由临床科室、样本库工作人员共同制定并确定一名临床协调人员，每日可采集病例由临床医生确定并签署知情同意书，一式三份，由临床科室、生物样本库、患者各执一份留存。

1.5 临床资料收集

我院 PCOS 入库样本临床资料已达到标准化、规范化，其中包括：基本信息（姓名、性别、年龄、身份证号、家庭住址、联系方式等），现病史（初诊日期、不孕类型、不孕年限、月经是否规律等），既往史（外伤手术史、预防接种史、输血及输血制品史），必备的检验/检查（血常规、尿常规、血型、基础内分泌、TORCH、甲状腺功能、血胰岛素、染色体及阴道 B 超等），诊疗计划（ART 方式、周期类型、治疗方式、治疗方案、用药方案、精子来源方式、卵子来源、存储方式以及培养方式等），手术记录（取卵日期、取卵时间、麻醉方式、卵巢大小、卵泡数量等），胚胎移植记录（移植日期、移植时间、子宫位置、导管进入宫腔次数、移植个数、胚胎残留、有无污染及移植后用药等），卵子处理记录（取卵日期、取卵时间、穿刺卵泡数、获卵数等），胚胎培养情况（培养囊胚数、形成囊胚数、高评分囊胚数、囊胚胚胎移植数等）以及随访资料等。

1.6 血液标本采集流程

符合纳入标准的患者均采集血液标本，血液样本进行术前血采集，其中 8 ml EDTA 抗凝和 5 ml 非抗凝真空采血管采集静脉血。详细填写样本采集登记表，室温静置 30 min 后，4 ℃低温离心 10 min，分离血清、血浆，按照每管 300 μl分装成 5 份，400 ×低温离心 30 min，于白膜层部提取白细胞，按照每管 300 μl 分装成 3 份，所有流程在 2 h 内分装完毕，置于–80 ℃保存。

1.7 卵泡液标本采集流程

符合纳入标准的患者均进行卵泡液标本采集，术中穿刺卵泡液 50 ml，详细填写样本采集登记表，室温静置 30 min 后，4 ℃低温 3000 r/min 离心 10 min，分离上清、沉淀，按照每管 15 ml 分装成 3 份并于–80 ℃保存。

1.8 质量控制流程

我院多囊卵巢综合征样本库定期对库内样本随机抽检进行质量控制，分别对 DNA 质量、定量和纯度、RNA 完整性以及样本的位置信息、临床信息（基本信息、手术记录、临床诊断、必须检查、辅助检查、治疗方案、随访信息）等规范性及完整性进行检测检查，同时第一时间获取科研使用者结果反馈。

2 结果

我院生物样本库已建有三种存储方式，分别为–196 ℃大型液氮存储、–86 ℃低温冰箱存储以及室温存储，多囊卵巢综合征卵泡液及血液样本于–86 ℃低温冰箱存储，同时按照标准化操作流程实施多囊卵巢综合征采集计划。截至 2016 年 10 月 28 日，我院成功收集百余例多囊卵巢综合征（包括原发不孕、继发不孕、子宫内膜异位症等）卵泡液（上清、沉淀），血液样本（血清、血浆、白细胞）。样本核酸提取及鉴定结果显示，DNA 完整性、RNA 纯度及总量完全满足科研需求。

3 讨论

近年来，转化医学已经成为基础医学研究与临床治疗连接，快速实现科学研究向工程应用的重要学科。生物样本库的构建能够将大量的临床获取的有效样本统一标准化、规范化采集、处理，将疾病标本充分地用于基础性研究。使得临床疾病标本能够更加有效利用，基础研究的取样来源更加快捷可靠。样本库对于样本的信息直接从临床管理系统中获取，来源更加准确快捷，避免了中间人工传抄的误差，同时又能够快速地将实验研究的信息反馈于临床的专科医生，信息传达位点更加精确，打破了传统医学研究到应用发展模式中的基础研究和临床应用之间的坚冰壁垒，使得基础信息和临床思维反复快速地整合，极大地促进了转化医学研究的发展。

随着自然环境因素和社会心理因素的改变，相比过去，年轻的生育群体中不孕不育以及多囊卵巢综合征患者数量呈明显升高趋势。尤其我国开放了二胎政策后，生育能力已经明显下降的大龄妇女要求生二胎的需求在不断增多。越来越多的人群开始关注生殖健康问题，多囊卵巢综合征除了会导致月经稀发和不孕不育等，还与代谢疾病（糖尿病[13]、胰岛素抵抗[14-15]、代谢综合征等[16]），心血管疾病[17]，肿瘤（子宫内膜癌[18]）等问题有较高的关联性和并发性。基于全院完整的生物样本库实时更新和信息的共享，可以完整地评价疾病标本对于开展的各项相关研究的价值性，有选择地参与多囊卵巢综合征不同方向、不同层次、不同组别的实验队列研究。此外，多囊卵巢综合征的生物标本，尤其是卵泡液标本，采集技术要求高，来源方式单一，基于多囊卵巢的相关调查研究，在样本容量和样本代表性上有很大的困难需要克服。

我院有发展规模成熟的生殖中心，长期稳定地开展各项辅助生殖技术，在院内已有的生物样本库的基础上，增设多囊卵巢综合征生物样本库，可以实时跟踪利用辅助生殖技术行卵巢穿刺取卵术过程中获取的卵泡液标本，并进行信息化管理与应用。坚持“来源于临床，服务于科研，资源共享、开放利用”的原则，极力构建标准化的多囊卵巢综合征生物样本库，深入开展多囊卵巢综合征及不孕不育等相关疾病的基础研究，促进多囊卵巢综合征相关的转化医学的发展。

[1] Ehrmann DA. Polycystic ovary syndrome. N Engl J Med, 2005, 352(12):1223-1236.

[2] Escobar-Morreale HF, Botella-Carretero JI, Álvarez-Blasco F, et al. The polycystic ovary syndrome associated with morbid obesity may resolve after weight loss induced by bariatric surgery. J Clin Endocrinol Metab, 2005, 90(12):6364-6369.

[3] Rosenfield RL, Ehrmann DA. The pathogenesis of polycystic ovary syndrome (PCOS): The hypothesis of PCOS as functional ovarian hyperandrogenism Revisited. Endocr Rev, 2016, 37(5):467-520.

[4] Azziz R. PCOS in 2015: New insights into the genetics of polycystic ovary syndrome. Nat Rev Endocrinol, 2016, 12(2):74-75.

[5] Yang S, Ding S, Jiang X, et al. Establishment and adipocyte differentiation of polycystic ovary syndrome-derived induced pluripotent stem cells. Cell Prolif, 2016, 49(3):352-361.

[6] Bacallao K, Plaza-Parrochia F, Cerda A, et al. Levels of regulatory proteins associated with cell proliferation in endometria from untreated patients having polycystic ovarian syndrome with and without endometrial hyperplasia. Reprod Sci, 2016, 23(2):211-218.

[7] Mikaeili S, Rashidi BH, Safa M, et al. Altered FoxO3 expression and apoptosis in granulosa cells of women with polycystic ovary syndrome. Arch Gynecol Obstet, 2016, 294(1):185-192.

[8] Ding L, Gao F, Zhang M, et al. Higher PDCD4 expression is associated with obesity, insulin resistance, lipid metabolism disorders, and granulosa cell apoptosis in polycystic ovary syndrome. Fertil Steril, 2016, 105(5):1330-1337. e3.

[9] Roth LW, McCallie B, Alvero R, et al. Altered microRNA and gene expression in the follicular fluid of women with polycystic ovary syndrome. J Assist Reprod Genet, 2014, 31(3):355-362.

[10] China Medicinal Biotech Association biobank standards (Trial). Chin Med Biotechnol, 2011, 6(1):71-79. (in Chinese)

中国医药生物技术协会生物样本库标准(试行). 中国医药生物技术, 2011, 6(1):71-79.

[11] Salimi-Asl M, Mozdarani H, Kadivar M. Up-regulation of miR-21 and 146a expression and increased DNA damage frequency in a mouse model of polycystic ovary syndrome (PCOS). Bioimpacts, 2016, 6(2):85-91.

[12] Campbell LD, Betsou F, Garcia DL, et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank, 2012, 10(2):232-233.

[13] Tavakolian Arjmand A, Nouri M, Tavakolian Arjmand S. Surprisingly low infertility rate in married type 2 diabetic women: A rather curious paradox to the current opinion of insulin resistance as the joint pathogenesis of poly cystic ovary syndrome and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Metab Syndr, 2015, 9(4):201-204.

[14] Banerjee U, Dasgupta A, Khan A, et al. A cross-sectional study to assess any possible linkage of C/T polymorphism in CYP17A1 gene with insulin resistance in non-obese women with polycystic ovarian syndrome.Indian J Med Res, 2016, 143(6):739-747.

[15] Glintborg D, Petersen MH, Ravn P, et al. Comparison of regional fat mass measurement by whole body DXA scans and anthropometric measures to predict insulin resistance in women with polycystic ovary syndrome and controls. Acta Obstet Gynecol Scand, 2016, 95(11): 1235-1243.

[16] Sahin Ersoy G, Altun Ensari T, Vatansever D, et al. Novel adipokines WISP1 and betatrophin in PCOS: relationship to AMH levels, atherogenic and metabolic profile. Gynecol Endocrinol, 2016, 30:1-5.

[17] Garg N, Dharmalingam M, Prabhu V, et al. Carotid intimo-medial thickness: A predictor for cardiovascular disorder in patients with polycystic ovarian syndrome in the South Indian population. Indian J Endocrinol Metab, 2016, 20(5):662-666.

[18] Lauretta R, Lanzolla G, Vici P, et al. Insulin-sensitizers, polycystic ovary syndrome and gynaecological cancer risk.Int J Endocrinol, 2016, 2016:8671762.

国家自然科学基金（81601343）；扬州市自然科学基金（YZ2016110）；扬州市科技计划项目（YZ2015068）；江苏省苏北人民医院院基金（yzucms201425）

225001 扬州大学临床医学院/江苏省苏北人民医院生物样本库（王丽萍、鲁军、潘云龙），生殖医学中心（张晓梅、吕芳、潘宇、李雪丽、何笑）

潘云龙，Email：yzpyl@medmail.com.cn

2016-11-01

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2016.06.013