甘蔗抗褐锈病基因与分子标记研究进展

仓晓燕，黄应昆，李文凤，王晓燕，单红丽，张荣跃

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远661699）

甘蔗抗褐锈病基因与分子标记研究进展

仓晓燕，黄应昆*，李文凤，王晓燕，单红丽，张荣跃

（云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远661699）

从甘蔗遗传图谱的构建，抗褐锈病基因的研究进展，抗褐锈病分子标记的开发，抗病基因研究策略进行综述，以期对甘蔗褐锈病的抗病育种工作提供科学指导和参考依据。

甘蔗；褐锈病；抗病育种；抗病基因；Bru1；分子标记

甘蔗褐锈病在全世界甘蔗种植区普遍发生[1]，病原物是黑顶柄锈菌（Puccinia melanocephala H.Sydow& P.Sydow）[2-3]。甘蔗褐锈病自1890年在印度尼西亚的爪哇首次发现以后[4]，1950年在印度发生，使主栽品种Co475被迫停种。1978年加勒比海地区（古巴、牙买加等）该病暴发，使T34362严重减产；当年在澳大利亚昆士兰北部发现该病，不久就遍及整个澳大利亚蔗区，产量损失10%～20%，近几年产量损失愈加严重[5]；同年美国佛罗里达州发生严重的褐锈病，使高抗病品种CP70-1133丧失抗性，1987年中感品种CP72-1210发病，产量损失20%～25%[4]；1988年CP78-1247严重受害，产量损失40%，该病现已遍及美国[6]。1981—1983年，墨西哥易感品种B4362产量损失50%[7]。在泰国中部，1991年受害严重，损失惨重，超过20%的种植面积严重受灾[8]。1995年蔓延到非洲毛里求斯，2010年在非洲埃塞俄比亚有报道发生[9]。

中国台湾发现褐锈病是1977年，栽培品种F176发病严重，大陆蔗区首次发现该病是在1982年[10]，1985年广东发现褐锈病，随后，福建、广西、海南蔗区陆续有该病发生的报道[11-13]。云南蔗区1982年调查时仅在昌宁、耿马蔗区零星发生，90年代由于品种单一，栽培条件不适宜，引种频繁和不良气候等原因，该病迅速蔓延，目前该病已遍布西南蔗区[14]。如果此病得不到有效控制，将会成为蔗糖业持续发展的制约因素[15]。

甘蔗锈病的发生流行与品种抗病性密切相关，大面积种植感病品种是病害流行的重要原因，选育和种植多样化的抗性品种是防治甘蔗锈病最经济有效的措施。抗褐锈病性中度到高度可遗传[16]给抗褐锈病育种带来曙光[17]，本文就甘蔗抗褐锈病基因及分子标记的研究进展进行综述，以期对今后抗病育种工作提供指导。

1 甘蔗的遗传图谱

甘蔗品种的基因组结构极为复杂，其染色体多为多倍体和非整倍体，约有120条染色体，大部分染色体来自热带种（S.officinarum），10%～15%来自割手密（S.spontaneum）[18]，尽管如此，甘蔗的遗传图谱已经建成[19-21]。

2 甘蔗抗褐锈病基因Bru1、Bru2的发现及确认

构建的遗传图谱，用来进行数量性状位点（QTL）分析[22-24]的研究已经在进行，锈病抗性长期以来认为是数量性状[25-27]控制。Daugrois（1996）[28]报道存在抗褐锈病的主效抗性基因，在R570的自交群体（171株）上进行抗褐锈病鉴定，抗∶感比例为3∶1，推测存在主效抗病基因，进行抗性基因的RFLP标记，该基因与最近的RFLP标记距离为10 cM。另外，Asnaghi等（2004）[29]在R570自交另一群体（695株）上再次确认主效基因的存在，把标记定位到基因两侧2.2和1.9 cM。Le Cunff等[30]（2008）在R570中，把Bru1定位在甘蔗CG VII 0.42 cM的区域内。

R570和MQ76-53的遗传图谱已经构建，R570图谱的累计长度是3144 cM，MQ76-53图谱累计长度是4329 cM。Raboin等[31]在MQ76-53图谱上，把抗褐锈病的Bru2基因定位于HG VIII的CG83，AFLP标记与Bru2距离为23 cM。Bru2和Bru1不同，Bru1位于R570的HGVII，另外，R570中的AFLP标记在MQ76-53中并不存在[32]，说明Bru2是新的抗褐锈病基因。

3 甘蔗抗褐锈病分子标记

3.1 PCR标记

发现R570中存在抗性基因Bru1后，研究主要集中在图位克隆上，但由于甘蔗为多倍体，只构建了高分辨率的遗传图谱和部分的物理图谱，发掘了R570中与Bru1连锁的分子标记[32]。Costet等[33]利用上述与Bru1连锁的分子标记，对来自世界30个育种中心的320个品种进行分析，获得22个与Bru1连锁的标记，利用与Bru1连锁的PCR标记R12H16和9O20-F4，分析了Bru1在现代甘蔗品种中的频率分布。

3.2 SSR标记

Santos等[34]在感褐锈病品种IACSP953018和抗性栽培品种IACSP933046进行抗褐锈病的分子标记及上位作用的研究，一共用488个单剂量标记（包括AFLP、gSSR、EST-SSR）进行分析，一共获得61个褐锈病的数量性状位点（QTL），在新植和宿根中有10个分子标记与褐锈病相关，其中抗锈病的标记有4个，分别是AFLP标记EcoAAG-MseCAT52.C、EmACG-MseCTC1.D1、EcoACT-fcfceCTT11.C，SSR标记SCB01.3C。后4个可以作为潜在的抗褐锈病的标记，特别是SSR标记SCB01.3C。

3.3 AFLP和RFLP分子标记

Mcintyre等[35]在2年的时间内对由优良甘蔗无性系Q117和74C42杂交得到的192个子代无性系的锈病抗性进行了评估，并使用SSR、扩增片段长度多态性标记（AFLP）以及限制性片段长度多态性标记（RFLP），约1000个单剂量标记筛选群体，4个标记（1个SSR和3个AFLP标记）与褐锈病抗性相关，并在澳大利亚优良种系（ECS）中进行筛选，来确定标记和性状之间关系是否有广谱适用性，鉴定到7个与褐锈病相关的AFLP分子标记：Acactg.16、Accctc.18、Accctc.20、Aacctc.12、Aggctc.20、Actcac.15、M39.5。

4 展望

4.1 Bru1基因和甘蔗褐锈病潜在替代来源

R570在法属留尼旺、东非和西非栽培20年[29]，未发现抗性丧失的现象，接种世界不同地区的黑顶柄锈菌菌株，但从未丢失过褐锈病抗性[32]，研究表明现代甘蔗品种的褐锈病抗性本质上依赖于Bru1基因[33]。在覆盖全球380份现代品种和育种材料中发现86%的褐锈病抗性材料中广泛含有Bru1[33]，为利用Bru1进行分子标记辅助育种和提高甘蔗褐锈病抗性提供了机会。

阿根廷甘蔗育种项目[36]结合田间评价和Bru1的分子诊断，评价了129份材料的褐锈病抗性，49份材料（38%）表现抗病性，仅有8份材料（16.3%）存在Bru1基因。为了确定当地种质资源的Bru1总体频率，对另外190份材料进行Bru1检测，仅有7%的材料（13份）检测到Bru1。李文凤等（2015）[37]利用PCR标记R12H16和9O20-F4，进行22份云南蔗区的生产品种抗褐锈病的分子检测，结果显示，14份抗褐锈病品种含抗褐锈病基因Bru1，另8个抗褐锈病品种未检测到抗褐锈病基因Bru1。为筛选原种抗性资源，提供抗褐锈病育种效率，李文凤等（2015）[38]对国家资源圃中34份甘蔗栽培原种进行抗锈病鉴定和Bru1的分子检测，发现26份材料为中抗到高抗褐锈病品种，占76.5%，其中1份抗病材料和8份感病材料不持有Bru1，显示国家资源圃中的抗褐锈病性主要由Bru1控制。为明确野生资源对褐锈病的抗性水平，了解Bru1在野生资源中的分布情况，李文凤等（2015）[39]对国家种质资源圃的31份甘蔗野生核心种质资源在苗期进行抗性鉴定和Bru1分子检测，发现中抗到高抗材料为28份，其中20份材料不持有Bru1，占供试材料的90.3%，推测这20份材料中可能持有不同抗性基因或位点。

美国佛罗里达运河点甘蔗育种项目[40]1072份杂交后代材料中，285份材料检测到Bru1（27%），1953年以前品种未检测Bru1，然而Bru1频率从1975—1985年的15%上升到近十年的47%，这一上升与佛罗里达褐锈病发生情况一致，说明遗传基础单一的抗性丧失容易引起病害流行。

4.2 甘蔗抗病基因研究策略

云南是世界甘蔗起源中心，有丰富的甘蔗遗传资源，从潜在的甘蔗抗病资源中挖掘抗病基因，进行抗病基因定位和分子标记开发的主要策略如下。

4.2.1 比较基因组学策略研究证明甘蔗、高粱、小麦这些物种有共线性[41-43]，特别是高粱是二倍体作物并有较小的基因组[44]，可作为甘蔗基因组分析的参考。Asnaghi等[32]通过比较三者的遗传图谱来确定抗锈病基因的两侧区域，加入217个单剂量标记到R570遗传图谱，其中66%的标记定位于R570连锁群LG VII，与抗锈病基因相邻，把基因定位在同源群HG VII，有19个RFLP标记，CDSR29离基因最近。Le Cuff等[30]采用比较基因组策略获得高分辨率的遗传图谱，获得与Bru1共分离的最近分子标记的距离分别为0.28 cM和0.14cM。

4.2.2 混合分组分析（bulked segregant analysis）策略第二种策略是利用高通量的AFLP、基因分型技术和混合分组分析法[45]。此外，通过将抗锈病位点定位到为蔗糖产量组分遗传分析构建的一张高密度图谱[19]间接获得目标区的AFLP标记，在Bru1基因的周围一共有8个AFLP标记，与Bru1基因最近标记的距离分别为1.9 cM和2.2 cM[29]。

4.2.3 抗病基因同源序列（RGA）类抗病基因策略第三种策略是开发抗病基因同源序列（RGA），许多植物抗病基因成功克隆揭示出这些基因聚集成簇，并且氨基酸高度保守，根据这些保守区设计引物，扩增到的序列称为抗病基因同源序列（RGA）。RGA与抗病位点或QTL连锁有报道，Rossi等（2003）把在甘蔗EST数据库中筛选到的RGAs整合到已构建的甘蔗遗传图谱[19，25，28]的Bru1附近。Mcintyre等（2005）[35]用54个RGAs作为抗病性鉴定的分子标记，2年的抗性鉴定结果表明，3个RGA标记与抗锈病性显著相关。

综上所述，寻找多样化的甘蔗抗褐锈病替代资源是提高甘蔗褐锈病抗性水平的重要方法，合理利用上述抗病基因定位策略，从潜在的甘蔗资源定位抗性基因或寻找抗病相关分子标记，可为防止抗性丧失造成锈病流行危害提供科学指导。

[1]Martin JP,Abbott EV,Hughes CG.Sugarcane diseases of the world：Vol.1[M].D.van Nostrand Company Ltd.london,1961.

[2]Ricaud C,Egan B T,Gillaspie A G,et al.Diseases of Sugarcane:Major Diseases[M].Amsterdam,Elsevier Science Publishers,1989.

[3]王云章，庄剑云.中国真菌志，第十卷.锈菌目（一）[M].北京：科学出版社，1998.

[4]刘晓妹，刘文波，施焕焕，等.甘蔗锈病研究进展[J].中国植保导刊，2007，27（12）：12-15.

[5]Brian Keating.Unlocking success through change and innovation:Options to improve the profitability and environmental performance of the Australian sugar industry[M].CRISO,2005.

[6]Hoy JW,Hollier CA.Effect of Brown Rust on Yield of Sugarcane in Louisiana[J].Plant Disease,2009,93(11):1171-1174.

[7]Comstock J C,Jmjr S,Raid R N.Effect of rust on sugarcane growth and biomass[J].Plant Disease,1992,76(2):175-177.

[8]马利，泰国甘蔗生产及科研现状[J].世界农业，1995(9)：23.

[9]Kelly PL，Reeder R，A Tafesse.First confirmed report of sugarcane common rust(Puccinia melanocephala)in Ethiopia[J].Plant Pathology，2010，58(6):1172.

[10]阮兴业，杨雰，孙楚坚.云南省发现甘蔗蔗茅柄锈菌[J].真菌学报，1982，2(4）：260-261.

[11]张学博.福建省甘蔗锈病的初步调查研究[J].植物保护，1990（S1）：10-12.

[12]韦金菊，邓展云，黄伟华，等.广西北海甘蔗锈病生物学特性研究及防治对策[J].安徽农业科学，2010，38（4）：14997-14999.

[13]刘晓妹，刘文波，施焕焕.海南儋州甘蔗锈病病原菌的鉴定及其生物学特性的测定[J].中国糖料，2008（2）：30-32.

[14]黄应昆，李文风.云南蔗区甘蔗锈病流行原因及防治对策[J].植保技术与推广，1998（5）：22-23.

[15]黄应昆，李文凤.现代甘蔗病虫草害原色图谱[M].中国农业出版社，2011.

[16]Ramdoyal K,Sullivan S,Chong L C Y L S,et al.The genetics of rust resistance in sugarcane seedling populations[J].Theoretical &Applied Genetics,2000,100(3/4):557-563.

[17]Wang X Y,Li W F,Huang Y K,et al.Evaluation of sugarcane introgression lines for resistance to brown rust disease caused by Puccinia melanocephala[J].Tropical Plant Pathology,2013,38(2):97-101.

[18]D'Hont A,Grivet L,Feldmann P,et al.Characterisation of the double genome structure of modern sugarcane cultivars(Saccharum spp.)by molecular cytogenetics[J].Molecular&General Genetics Mgg,1996,250(4):405-413.

[19]Hoarau J Y,Offmann B,D’Hont A,et al.Genetic dissection of a modern sugarcane cultivar(Saccharum spp.).I.Genome mapping with AFLP markers[J].Theoretical&Applied Genetics,2001,103(1):84-97.

[20]Aitken K,Jackson PA,McIntyre CL.Construction of a genetic linkage map of a sugarcane cultivar(Saccharum spp.)using AFLP and SSR markers[J].Theoretical and applied genetics,2005,110:789-801

[21]Rossi M,Arujo P,Paulet F et al.Genome distributionand characterization of EST derived sugarcane resistance gene analogs[J]. Molecular Genetics and Genomics,2003,269:406-419.

[22]Hoarau JY,Grivet L,Offmann B,et al.Genetic dissection of a modern sugarcane cultivar(Saccharum spp.).II.Detection of QTLs for yield components[J].Cheminform,2002,105(6/7):1027-1037.

[23]Ming R,Wang Y W,Draye X,et al.Molecular dissection of complex traits in autopolyploids:mapping QTLs affecting sugar yield and related traits in sugarcane[J].Theoretical and applied genetics,2002,105:332-345.

[24]Reffay N,Jackson PA,Aitken K A,et al.Pedigree analysis using mapped molecular markers in sugarcane enables quantitative trait loci(QTLs)to be traced to ancestral species[J].Molecular Breeding,2005,15:367-381.

[25]Grivet L,D'Hont A,Roques D,et al.RFLP mapping in cultivated sugarcane(Saccharum spp.):genome organization in a highly polyploid and aneuploid interspecific hybrid[J].Genetics,1996,142(3):987-1000.

[26]Tai PYP,Miller JD,Dean JL.Inheritance of resistance to rust in sugarcane[J].Field Crops Research,1981,4:261-268.

[27]Hogarth DM,Ryan CC,Taylor PWJ.Quantitative inheritance of rust resistance in sugarcane[J].Field Crops Research,1993,34: 187-193.

[28]Daugrois J H,Grivet L,Roques D,et al.A putative major gene for rust resistance linked with a RFLP marker in sugarcane cultivar‘R570’[J].Theoretical&Applied Genetics,1996,92(8):1059-1064.

[29]Asnaghi C,Roques D S,Kaye C,et al.Targeted mapping of a sugarcane rust resistance gene(Bru1)using bulked segregant analysis and AFLP markers[J].Theoretical&Applied Genetics,2004,108(4):759-764.

[30]Le Cunff L,Garsmeur O,Raboin LM et al.Diploid/polyploid syntenic shuttle mapping and haplotypespecific chromosome walking toward a rust resistance gene(Bru1)in highly polyploid sugarcan[J].Genetics,2008,180(1):649-660.

[31]Raboin L M,Oliveira K M,Lecunff L,et al.Genetic mapping in sugarcane,a high polyploid,using bi-parental progeny:identification of a gene controlling stalk colour and a new rust resistance gene[J].Theoretical&Applied Genetics,2006,112(7):1382-1391.

[32]Asnaghi C,Paulet F,Kaye C,et al.Application of synteny across Poaceae to determine the map location of a sugarcane rust resistance gene[J].Theoretical&Applied Genetics,2000,101(6):962-969.

[33]Costet L,Cunff L L,Royaert S,et al.Haplotype structure around Bru1 reveals a narrow genetic basis for brown rust resistance in modern sugarcane cultivars[J].Theoretical&Applied Genetics,2012,125(5):825-836.

[34]Santos F R C,Pinto L R,Carlini-Garcia L A,et al.Marker-trait association and epistasis for brown rust resistance in sugarcane[J]. Euphytica,2014,203(3):533-547.

[35]Mcintyre C L,Whan V A,Croft B,et al.Identification and Validation of Molecular Markers Associated with Pachymetra Root Rot and Brown Rust Resistance in Sugarcane Using Map-and Association-based Approaches[J].Molecular Breeding,2005,16(2):151-161.

[36]Racedo J,Perera M F,Bertani R,et al.Bru1 gene and potential alternative sources of resistance to sugarcane brown rust disease[J]. Euphytica,2013,191(3):429-436.

[37]李文凤，王晓燕，黄应昆，等.甘蔗抗褐锈病基因Bru1分子检测体系的建立与应用[J].植物保护，2015，41(2)：120-124.

[38]李文凤，王晓燕，黄应昆，等.34份甘蔗栽培原种抗褐锈病性鉴定及Bru1基因的分子检测[J].分子植物育种，2015(8)：1814-1821.

[39]李文凤，王晓燕，黄应昆，等.31份甘蔗野生核心种质资源褐锈病抗性鉴定及Bru1基因的分子检测[J].作物学报，2015，41(5)：806-812.

[40]Glynn N C,Laborde C,Davidson R W,et al.Utilization of a major brown rust resistance gene in sugarcane breeding[J].Molecular Breeding,2013,31(31):323-331.

[41]Grivet L,D'Hont A,Dufour P,et al.Comparative genome mapping of sugar cane with other species within the Andropogoneae tribe[J].Heredity,1994,73:500-508.

[42]Dufour P,Grivet L,D'Hont A,et al.Comparative genetic mapping between duplicated segments on maize chromosomes 3 and 8 and homoeologous regions in sorghum and sugarcane[J].Theoretical&Applied Genetics,1996,92:1024-1030.

[43]Ming R,Del Monte TA,Hernandez E,et al.Comparative analysis of QTLs affecting plant height and flowering among closelyrelated diploid and polyploid genomes[J].Genome,2002,45:794-803.

[44]Arumuganathan K,Earle ED.Nuclear DNA content of some important plant species[J].Plant Molecular Biology Reporter,1991,9: 208-218.

[45]Michelmore RW,Paran I,Kesseli RV.Identification of markers linked to disease-Resistance genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using a segregating population[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1991,88:9828-9832.

[46]Wang Z,Taramino G,Yang D,et al.Rice ESTs with disease-resistance gene-or defense-Response gene-like sequences mapped to regions containing major resistance genes or QTLs[J].Molecular Genetics&Genomics,2001,265:302-310.

Research Progress of Sugarcane Brown Rust Resistance Gene and Its Molecule Markers

CANG Xiao-yan,HUANG Ying-kun*，LI Wen-feng,WANG Xiao-yan,SHAN Hong-li,ZHANG Rong-yue
(Sugarcane Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Province Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement,Kaiyuan 661699,China)

Sugarcane genetic map construction,main r esistance gene of sugarcane brown rust,brown rust resistance related markers and rust resistant gene research strategies were summarized,in order to provide scientific guidance and references for rust resistance breeding of sugarcane.

S566.103；Q78

B

1007－2624（2016）06－0062－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.06.022

2016-06-20

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-20-2-2)；云南省现代农业产业技术体系建设专项资金。

仓晓燕(1983-)，女，研究实习员，主要从事甘蔗病害研究。E-mail：67454340@163.com

黄应昆(1964-)，男，研究员，主要从事甘蔗病虫害防控研究。Tel：0873-7227017，E-mail：huangyk64@163.com

Key worlds：sugarcane;brown rust;resistance breeding;resistance gene;Bru1;molecule markers