心脏肌成纤维细胞活化的力学调控

张蓓蓓 蔡辉

210002南京军区南京总医院中西医结合科

·综述·

心脏肌成纤维细胞活化的力学调控

张蓓蓓 蔡辉

210002南京军区南京总医院中西医结合科

在心肌修复或纤维化过程中，以成纤维细胞为主的多种前体细胞向心脏肌成纤维细胞(CMFs)活化，合成大量细胞外基质成分，并持续存在于心肌瘢痕中。CMFs活化除了受促纤维化因子的调控外，还受力学因素的影响。ECM刚度增加及循环应变的改变能促进CMFs活化推动心肌纤维化持续进展。通过调控CMFs对机械应力的敏感性来抑制CMFs活化的方法有可能成为心肌纤维化治疗的新选择。

成纤维细胞; 机械应力; 心肌纤维化; 细胞外基质

细胞是人体的基本结构和功能单位，其生物学行为不仅受微环境中化学信号的影响，还普遍受力学因素的调控。心脏肌成纤维细胞(cardiac myofibroblasts，CMFs)是心肌组织损伤修复和纤维化过程中合成胶原性细胞外基质(extracellular matrix，ECM)最主要的细胞[1-2]。正常心肌组织中一般不存在CMFs，但急性心肌损伤或长期压力负荷过重可诱导多种前体细胞向CMFs表型活化，这个过程对维持心脏结构和功能具有重要意义。然而，持久而过度的CMFs活化可导致病理性ECM沉积与重构，即心肌纤维化。长期以来，对CMFs调控的机制研究主要集中在化学因素方面，如可溶性因子、细胞因子、基质细胞蛋白和细胞外蛋白等[3-4]。而随着体外应力加载装置的出现，力学因素对CMFs活化的作用越来越受重视。对在体心脏来说，由心肌细胞节律性搏动产生的循环载荷应力-应变及ECM刚度是最主要的力学因素。本文综述了CMFs活化的力学调控，以期为以CMFs为靶目标的抗心肌纤维化研究提供新的思路。

1 CMFs的来源、活化及鉴别

1.1 CMFs的来源

参与纤维化和心肌修复的CMFs来源于各种不同的细胞，其中心肌局部来源包括心脏成纤维细胞(cardiac fibroblast，CFs)、血管相关平滑肌细胞和血管周细胞。此外，上皮-间充质细胞转化、内皮-间充质细胞转化、纤维细胞和其他髓系祖细胞也是损伤后CMFs的来源[5]。这些前体细胞对纤维化心肌中CMFs的相对贡献是一个争论激烈的问题。更复杂的是，CMFs前体细胞的募集似乎与物种、诱发因素及前体细胞在心脏中的位置均有关[6]。可以认为接收心肌损伤信号的许多细胞均有机会激活为CMFs。

1.2 CMFs的活化

作为正常心肌中数量最多的细胞类型，CFs是CMFs最主要的来源，也是本文重点关注的前体细胞。CFs和其他CMFs的前体细胞内一般不含应力纤维，但在机械应力的作用下细胞质内肌动蛋白和肌球蛋白可形成应力纤维[7-8]，即发育成“原-CMFs”。应力纤维终止于细胞膜表面包含整合素受体的黏着斑复合物，后者能感应并传递ECM的机械刺激。随着ECM所受应力和刚度的增加，“原-CMFs”内初始的小黏着斑发展成大的超成熟黏着斑，并诱导化学信号，如转化生长因子-β(TGF-β)和纤连蛋白细胞外片段的表达，促使α-平滑肌细胞肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)进入应力纤维。这些具有强收缩力且α-SMA阳性的细胞最初被称为“分化成熟的CMFs”。如果根据CMFs是终末细胞的传统观念，细胞凋亡应是它们在组织中消失的唯一方式，但最近有研究证明，CMFs可以被逆分化，是一种细胞表型，而不是一种细胞类型[9]。因此，CMFs“活化”似乎比“分化”这个词更为合适。

1.3 CMFs的鉴别

α-SMA在应力纤维的表达是目前运用最广泛的鉴别MFs的方法，但血管平滑肌细胞和周细胞也表达α-SMA，因此为了区别这些不同的细胞类别需要寻找新的标记方法。例如，联合结蛋白(表达于平滑肌细胞和心肌细胞)和内皮细胞标记物(如CD31或VE-钙粘素)的检测方法能更可靠地将小血管与MFs区别开来。除了根据细胞骨架标记识别MFs外，转基因小鼠模型也被用于识别和锚定纤维化组织中的MFs及其前体细胞。现已实现利用Ⅰ型胶原-绿色荧光转基因小鼠来追踪观察肝中MFs的来源[10]。血小板源性生长因子受体β(platelet-derived growth factor β，PDGFRβ)表达升高是多个器官MFs活化的早期标志。PDGFRβ-Cre重组酶作用下αv基因的条件性缺失可阻止纤维化的肝、肺和肾脏中的周细胞向MFs活化[11]，但这种方法在心脏中是否有效仍需论证。虽然PDGFRβ阳性的周细胞是肝[12]和肾纤维化组织中MFs的主要来源，但它们在心脏中的功能尚不清楚。事实上，PDGFRβ阳性且表达转录因子Gli1的周细胞亚群具有间充质干细胞的特征，在实验性心肌纤维化过程中起主要作用[13]。PDGFRα则表达于平滑肌祖细胞，由于其表达水平在多器官纤维化和损伤修复过程中均上调，PDGFRα 启动子驱动也被用于追踪CMFs的发育过程[14]。

2 CMFs的力学调控

心肌组织的ECM是由CFs分泌的Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤维蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白等物质在心肌细胞附近组建的网架结构。CFs调控ECM平衡能为心肌细胞电传导提供稳定的介质，以保障心脏快速、协调的舒缩活动。CFs除了在TGF-β依赖和非依赖信号、血管紧张素Ⅱ[15]、内皮素-1、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、PDGF和β-连环素/ Wnt[16]等可溶性细胞因子的调控下会活化为CMFs，机械载荷及ECM应力的改变[17-18]对CMFs活化也有重要影响。大量学者利用体外细胞培养系统及应力加载装置对CMFs的力学调控进行了研究。

2.1 心肌ECM的力学性能

若将心肌组织当作一种弹性材料，则可以从拉伸强度、断裂伸长率、硬度、弹性模量、冲击强度等指标评估其力学性能。杨氏模量又称拉伸模量是单位面积弹性材料产生应变所需要的应力，是弹性模量中最常见的一种，可用来衡量材料的刚度。使用原子力显微镜测量正常心肌的杨氏模量为10～15 kPa，而纤维化心肌组织由于正常的ECM结构被顺应性低的胶原瘢痕所替代，测得的杨氏模量增加了2～10倍(20～100 kPa)，则心肌细胞收缩的载荷明显加重。而未得到有效控制高血压有可能会进一步加重心肌载荷，这种力学性能的改变能激活TGF-β从而活化MFs[19]。ECM力学性能的改变除了调控CMFs活化外，也能干扰其他心肌组织细胞，例如阻碍正常的心肌祖细胞分化成熟，影响心肌细胞收缩[20]。

2.2 培养基刚度对CMFs活化的作用

目前大多采用二维细胞培养系统观察研究成纤维细胞，由于其具有易操作、适用多种分析技术和利于细胞繁殖的特点，明显优于复杂的三维细胞培养、动物实验和临床研究，但并不能很好地模拟生理条件。其一，传统聚苯乙烯平板培养基的刚度(GPa)比正常甚至纤维化心肌高约十万倍[21]。其二，成纤维细胞培养液成分之一的血清(浓度为5 %～10%)在不同批次和厂家间可能有很大差异，且血清中bFGF的相对含量决定了培养液对CMFs活化有促进还是抑制作用，已证实后者能抑制MFs和潜在的TGF-β1活化[22]。其三，成纤维细胞培养的氧浓度明显高于通常较低的组织氧含量，在人体外科手术和动物实验中检测到的心肌组织氧分压为19～22 mmHg，仅相当于1%～5%氧浓度。在体外培养条件下，培养基刚度、血清浓度、氧分压均是促使MFs活化的重要驱动因素，且CFs可能与其他器官成纤维细胞表现出不同的反应阈值。除非严格控制培养条件，否则原代培养的成纤维细胞中很可能部分活化为MFs，造成体外和体内实验结果不一致。因此，联合使用二维和三维培养系统，而不是只选择其中一种有助于提供更多有价值的信息。

高弹性聚合物水凝胶的出现使得培养基刚度对MFs活化的影响大大减弱。这种主要由聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或硅橡胶等弹性材料做成的二维柔性培养基刚度与组织非常相近，且光学性能与塑料培养基一致。杨氏模量1～3 kPa为聚丙烯酰胺凝胶可以抑制成纤维细胞应力纤维发育及“原-MFs”形成。在刚度稍大一点的培养基上，成纤维细胞内出现不含α-SMA的应力纤维。刚度更大的凝胶或硅橡胶培养基(杨氏模量≈20 kPa)则可引起进一步的MFs活化，特征为α-SMA进入应力纤维[23]。最近，具有刚度各向异性的光控水凝胶被加入到细胞培养基行列中[24]。通过辐照降低光降解水凝胶局部的刚度可以逆转心脏瓣膜间质细胞(valvular interstitial cells，VICs，其本质上是一种成纤维细胞)向CMFs的活化[25]。需要注意的是，同样是弹性模量为1～3 mPa的传统聚二甲基硅氧烷硅胶膜虽然可以发生变形，但对成纤维细胞来说属于刚性基质。总的来说，胶原蛋白或纤维蛋白凝胶是柔性还是刚性基质一般取决于其中生物聚合物的浓度(通常为1～5 mg/ml)，但还受到成纤维细胞重构的强烈影响，后者可造成力学性能的各向异性分布[26]。在一种新的模拟梗死后心肌不同部位力学改变的体外模型中，刚度相对大的部位更容易发生CMFs活化[27]。

2.3 循环应变对CMFs活化的作用

由于心肌规律性的收缩和舒张运动，成纤维细胞和CMFs不论是在柔性还是刚性ECM中均受循环应变的影响。在体外实验中，将循环应变加载至培养成纤维细胞的二维硅胶膜或在三维生物聚合物凝胶通常能促进Ⅰ型胶原和纤维蛋白合成[28]。应变速率(范围从1%～20 %)和应变周期是造成循环应变对CMFs效应不同的最主要原因。此外，CFs内α-SMA基础水平对应变作用的结果也有影响。在一个借助胶原包被磁珠为CFs提供恒定拉力的模型中，新生大鼠CFs培养1 d后α-SMA表达水平极低，给细胞加压4 h后α-SMA表达增加了1.5～2.0倍；在刚性基底上培养3 d后CFs内α-SMA表达水平明显升高，而此时细胞加压4 h后α-SMA表达下降了32 %[29]。Husse等[30]研究发现，循环应变可能通过蛋白激酶和酪氨酸激酶信号介导成纤维细胞合成ECM成分。Song等[31]报道，核因子-κB和活化蛋白-1能以pellino-1依赖性方式参与循环应变对CFs的作用。

许多研究报告了采用特定实验装置加载循环应变对CMFs活化的负性作用。在三维凝胶培养VICs的条件下，循环等轴应变(20%、1 Hz)能促进成纤维细胞表型表达，明显降低α-SMA表达，而增强所加载应变的各向异性则能够提高α-SMA的表达促进CMFs活化[32]。也有报道，循环等双轴应变(15%、1 Hz)的加载更有利于同样条件下二尖瓣VICs表达成纤维细胞表型，而额外添加活性TGF-β能够拮抗循环等双轴应变的作用诱导CMFs活化和α-SMA表达[33]。在另一项结合流体剪切应力观察循环应变作用的研究中，循环应变(5%，1 Hz)通过改变Smad2磷酸化状态降低α-SMA的表达，而流体剪切应力能诱导TGF-β和血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)信号发挥相反的作用[34]。这些研究表明，在一定条件下的循环应变能抑制CMFs活化。乍一看这些研究结果与CMFs活化需要机械应力的背景知识不符，然而这些结果与CFs能自适应正常心动周期中的循环应变而不发生CMFs活化的事实是一致的。

2.4 循环应变与基质刚度对CMFs活化的共同作用

在不同弹性模量培养基上加载循环应变的研究显示，基质刚度对成纤维细胞行为的作用是短暂的，而循环应变的作用是持久的[35]。有趣的是，在柔性基底上接受循环应变的细胞行为与刚性基底上的细胞行为相似，这表明循环应变在刺激成纤维细胞铺展、应力纤维形成和生长方面的作用可以代替刚性基底[36]。在应力松弛的粘弹性基底上培养的成纤维细胞也有类似的应力纤维形成与细胞增殖行为[37]。随着时间的推移，在粘弹性基底上细胞保持相同形变需要的力会逐渐变小，这一特性使粘弹性基底较用聚丙烯酰胺或硅胶制成的弹性基底能更好地模拟成纤维细胞的生物力学微环境。

3 CMFs对力学刺激的应答

3.1 力学刺激对CMFs的影响

ECM刚度和循环应变对CMFs的影响是多方面的：(1)高应力是α-SMA进入应力纤维和细胞收缩性增强所必需的；(2)应力直接调节α-SMA启动子的活性和蛋白表达；(3)基质顺应性通过调节胞质Ca2+信号控制CMFs收缩[38]；(4)应变和机械载荷能调节TGF-β1的生物活性，后者是一种重要的促CMFs分化因子。因此，减小ECM刚度产生的应力及改变应变状态或许可以抑制CMFs活化防治心肌纤维化，但由于人体内心肌ECM的力学条件很难被改变，在实际工作中可以考虑通过调控CFs对力学刺激的敏感性以达到抑制CMFs活化的目标。

3.2 CMFs对力学刺激的感应

CFs能感知并响应微环境中的力学信号，并将此信号转化为化学信号。整合素是重要的力学感受器，能够将具有收缩功能的肌动蛋白/肌球蛋白细胞骨架与ECM相连接，方便细胞捕捉周围环境中的力学信号[39]。CFs和CMFs表达多种不同的整合素，包括胶原受体整合素α1β1、α2β1、α11β1、和α1β3和纤连蛋白结合整合素α5β1、α8β1、αvβ1、αvβ 3和αvβ5。除了构成黏着斑连接细胞与ECM外，整合可以特异性结合纤连蛋白配体隐藏结构域，后者在应变的作用下才会暴露出来[40]。整合素参与的ECM收缩还可以促进TGF-β1活化，这为复杂的“间接力学感应”机制增添了新内容[41]。细胞膜机械敏感性通道与整合素结合是CFs感应力学刺激的另一个主要机制和治疗目标。例如，瞬时受体电位香草酸亚型4(TRPV4)是一种机械敏感性离子通道，能够介导刚性基底上肝、肺和心脏MFs活化和纤维化。TRPV4能调节CFs胞质钙浓度，对TGF-β1诱导的CMFs活化也是必需的[42]。

3.3 CMFs对力学刺激的传导

力学信号传导有赖于细胞内肌动蛋白/肌球蛋白的收缩。因此，抑制肌球蛋白运动(如使用肌球蛋白轻链抑制剂)和破坏肌动蛋白微丝(如使用细胞松弛素D或jasplakinolide)可以阻碍力学信号的传导。这些化合物由于缺乏细胞特异性，能彻底阻止心肌收缩和肌动蛋白丝形成，用于人体造成的治疗相关损伤可想而知。而抑制RhoA/Rho相关激酶(ROCK)活性，一条主要参与非肌细胞内应力纤维形成的信号转导途径，能够在不引起严重不良反应的情况下阻碍CMFs对力学刺激的感应和活化[43]。在心脏和肺纤维化实验模型中，ROCK抑制剂被认为是非常有前景的抗纤维化药物。另外长时间应用能直接、特异性地抑制α-SMA的多肽由于能够减小细胞内应力，也有望取得良好的疗效。因此，以CMFs收缩为靶目标的抗纤维化治疗具有双重作用，一方面抑制组织挛缩，另一方面干扰促使CMFs活化的力学信号传导。

最近，有人提出了干扰与转录因子Yorkie同源的Yes相关蛋白(YAP)和PDZ结合域转录共激活蛋白(TAZ)的治疗方案。YAP和TAZ对机械应力的感应至关重要，ECM力学线索、细胞黏附位点、细胞形状和肌动球蛋白骨架等信号都被整合到细胞核YAP/ TAZ复合体，后者向核仁转位从而调节基因表达[44]。YAP / TAZ活性升高被证明能促进多种细胞向CMFs活化。另一个参与力学信号传导的因子是巨核细胞白血病因子1，也叫心肌素相关转录因子(myocardinrelated transcription factor，MRTF)，通过肌动蛋白的聚合状态将机械应力与各种CMFs祖细胞内α-SMA基因的转录活性相关联。MRTF在刚性基底上以RhoA/ROCK依赖的方式易位到细胞核，加速纤维化进程[45]。MRTF-A基因敲除可使成纤维细胞耐受刚性基底诱导的CMFs活化，而MRTF-A基因过表达或持续性活化可使成纤维细胞在柔性基底上发生CMFs活化[46]。

4 小结

前面主要综述了力学刺激活化CMFs的机制，也讨论了不同基质刚度和外界载荷对体外培养的CFs向CMFs活化的影响，但通过改变心肌ECM刚度和循环应变以抑制CMFs活化的方法在心肌纤维化的临床治疗中很难实践。虽然成纤维细胞对力学刺激的感应易受药物干预，但许多涉及该过程的信号途径和蛋白质也参与了细胞收缩的调节，所以靶向作用于CMFs的抗心肌纤维化药物将是不妨碍心肌细胞正常功能的关键。随着能够产生特定力学条件的小型化系统的开发，具有更高效率且更接近生理条件的装置将使CFs的研究更为方便。

利益冲突：无

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(本文编辑：周白瑜)

Mechanical regulation of cardiac myofibroblast activation

ZhangBeibei，CaiHui

DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，Nanjing210002，China

CaiHui，Email：njzy_caihui@163.com

In the process of myocardial repair or fibrosis，cardiac myofibroblasts (CMFs) based precursor cells are activated.CMFs synthesize large amounts of extracellular matrix (ECM) components and persist staying in the myocardial scar.CMFs activation is regulated by pro-fibrogenic cytokines and mechanical factors.The increased stiffness of ECM and change of cyclic strain can aggravate myocardial fibrosis by maintaining CMFs activation.Inhibition of CMFs activation by regulating sensitivity of CMFs to mechanical stress may be a new choice of myocardial fibrosis treatment.

Fibroblasts； Mechanical force； Cardiac fibrosis； Extracellular matrix

蔡辉，电子信箱：njzy_caihui@163.com

10.3969/j.issn.1007-5410.2016.06.017

2016-03- 07)