间充质干细胞与肝缺血再灌注损伤

李势辉 郭宇 杨扬

·综述·

间充质干细胞与肝缺血再灌注损伤

李势辉 郭宇 杨扬

肝脏手术中普遍发生的缺血再灌注损伤（IRI）可导致肝脏功能损害，目前尚缺乏确切有效的治疗手段。肝脏IRI的机制复杂，炎症反应失衡主导的损伤继发于肝脏理化损害之后，并具有全身性的特点。间充质干细胞（MSC）所具备的免疫调节功能与肝脏IRI中免疫失衡这一重要病理生理过程相契合，凭借其易获取、低免疫源性的特点，故可尝试用于IRI的治疗。目前多项试验初步验证了其有效性，但确切机制有待进一步明确。可见，MSC用于肝脏IRI的治疗拓展了细胞治疗的应用范围，并为肝脏IRI提供了可能的治疗手段。

间质干细胞； 再灌注损伤； 肝疾病

肝脏手术中普遍发生的缺血再灌注损伤（ischemiareperfusion injury，IRI）可导致肝脏功能损害，目前尚缺乏确切有效的治疗手段［1］。目前认为，间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）对肝脏的IRI具有治疗作用。本文总结MSC治疗IRI的相关文献报道，对相关的病理生理机制和该领域的最新进展进行简要评述。

IRI是由缺血的组织或器官恢复血流灌注导致的结构、功能及代谢的恶化，主要包括水肿、出血、坏死及自由基损害效应。肝脏IRI除造成肝脏实质细胞功能障碍外，还可诱导多种间质细胞、免疫细胞活化，引发细胞表面分子及细胞因子的异常表达，形成连锁式反应，影响肝脏结构及功能。肝窦内皮细胞是一类结构特异的含有窗孔的内皮细胞，直接与肝内血流相接触，是IRI过程中首先受到血流理化因素变化影响的细胞群。新近研究［2］表明肝窦内皮细胞在肝脏炎症反应中扮演了重要角色，因而与肝脏IRI密切相关。肝窦内皮细胞在缺血再灌注的早期即可出现结构及功能的损害［3］。肝脏IRI期间，肝内血流停滞，可诱导肝窦内皮细胞表面分子表达改变，具有血管保护作用的Krüppel样因子表达下调，肝内内皮氧化氮合酶、血栓调节蛋白及血红素氧化酶基因表达下降，早期即可引发肝窦内皮细胞死亡［4］。而再灌注后血清中明显升高的纤维介素与肝窦内皮细胞表面受体FCγRIIB结合，造成肝窦内皮细胞进一步损害并导致肝细胞死亡［5］。肝窦内皮细胞受损造成肝血窦结构破坏，从而引发血栓形成及白细胞聚集等继发免疫损害。可见，在肝脏IRI过程中，除代谢障碍造成的肝功能损坏外，肝窦内皮细胞是重要的始动因素，早期对肝窦内皮细胞的保护显得尤为重要。在IRI序贯并进式的损伤过程中，再灌注对肝细胞的损害相较缺血期更为显著，逐步成为肝损害主要表现，IRI所致的肝细胞非细菌性坏死可激活机体固有免疫应答，其释放的损伤相关分子模式可激活Toll样受体-9及髓样分化因子-88介导的细胞毒作用，揭示了肝实质细胞缺血损伤同自身免疫介导损害间的潜在关系［6］。IRI过程中受损细胞释放的损伤相关分子模式成分多样，其中高迁移率族框1蛋白质可激活Toll样受体-4及Toll样受体-9，介导肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）及白细胞介素（interleukin，IL）-6的表达，加剧IRI，同时可诱导中性粒细胞大量浸润并形成胞外杀菌网络直接损害肝脏细胞，并且同肝内Kupffer细胞相互促进，发挥协同损伤作用［7-8］。实验结果充分体现了肝脏IRI中初始低氧、低代谢损伤同机体固有免疫及适应性免疫应答损害的相关性及序贯性特点。随着研究的深入，介导肝脏IRI的分子机制不断被发现，除前面所述的自由基损害、炎性介质失衡、趋化因子异常表达、固有及适应性免疫应答过度激活外，一些新的机制如心磷脂氧化产物的变化效应［9］、乙酰化作用［10］等亦被发现在肝脏IRI中发挥了重要作用，但目前尚未发现单一主导作用的分子机制。肝损伤除自身复杂效应外，肝脏IRI同其他器官密切相关，如脑死亡可加重供肝IRI［11］，缺血预处理可以减轻肝脏IRI［12］；同时肝脏IRI可诱导全身多发器官损害效应，术中临时肝血流阻断后，急性肾损害发生率约40﹪ ～ 80﹪，而肝移植后发生率高达95﹪［13］。可见，肝脏IRI是以肝损害为突出表现的全身炎症反应失调过程，目前动物实验中针对单一因素的干预治疗虽显现出一定的效果，但绝大多数临床作用有限或临床转化困难。而基于MSC的细胞治疗以其自身的优势为肝IRI的治疗提供了新的希望。

MSC是一类具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，并可以通过多种方式干预炎症反应［14］。MSC表面不表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子及分化簇（cluster of differentiation，CD）80、CD86、CD40等共刺激分子，因此免疫原性及抗原提呈能力弱［15-16］。体外实验证实，MSC与同种异体T细胞共培养不会引起T细胞显著增殖［15］；体内实验中输注异种MSC不仅耐受良好而且可发挥免疫调节作用［17］；后续临床试验亦证实同种异体MSC治疗不会引起受体免疫细胞的攻击效应［18］。同时MSC来源丰富，合适的体外培养条件下扩增迅速、功能稳定，而且骨髓、脐带、脂肪等多种不同来源的MSC应用试验效果相近。MSC所具备的这些特点，为MSC临床广泛应用奠定了坚实的基础。MSC可通过旁分泌或趋化富集于IR受损器官，介导免疫调节、抗凋亡、促进血管生成、促进干细胞及祖细胞增殖分化、抗纤维化、调节趋化或于受损部位分化修复受损组织，从而发挥治疗效应，其肯定的疗效已在多种疾病模型及临床试验中得以验证。心肌梗死是缺血性疾病的代表，其动物模型中可观察到MSC通过多种细胞表面分子如基质细胞衍生因子1-α、单核细胞趋化蛋白-1、细胞间黏附分子-1等趋化募集并向血管外迁移最终富集于缺血心肌组织［19］，进而发挥再生及抗纤维化作用；而且临床试验表明，MSC治疗有助于改善患者心功能并提高生活质量［20］。在肺损伤、脓毒症等动物模型中运用MSC治疗，均可改善预后［21-22］。近年来，MSC治疗移植物抗宿主病取得了可喜的成效，Lucchini等［23］报道，11例免疫抑制剂治疗无效的移植物抗宿主病儿童应用MSC治疗后，总反应率达71.4﹪，完全反应率23.8﹪，为难治性移植物抗宿主病的治疗提供了新的思路。可见，MSC为新兴的细胞治疗提供了有力的武器。

MSC发挥器官保护作用的机制多样，其调控炎症反应作用与IRI损伤中免疫失衡这一重要病理生理过程相契合。MSC对炎症反应的调控涉及免疫活化、效应及免疫稳态的维持全过程。MSC在体、内外实验中均可显著抑制参与固有免疫应答细胞的功能：MSC可以通过TNF-α及前列腺素E2介导Kupffer细胞表型及细胞因子由促炎向抗炎转变［24］；体内巨噬细胞自然条件下多为M1型，通过分泌TNF及IL-1β发挥促进炎症反应效应，当予以输注MSC后，可诱导巨噬细胞表型由M1型向M2型转换，分泌IL-10等发挥抑制炎症反应的作用［25］；另一类重要的固有免疫细胞自然杀伤细胞应答过程中，MSC可以抑制树突状细胞（dendritic cells，DC）介导的自然杀伤细胞干扰素γ的表达，进而抑制自然杀伤细胞的功能［18］。其次，MSC可作用于适应性免疫应答的抗原提呈及效应阶段：研究表明，MSC可弱化TNF-α诱导的DC细胞的成熟过程，Liu等［26］研究发现，MSC通过释放TNF诱导蛋白-6下调DC细胞表面分子CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ类、CD11c及IL-12的合成，可能是MSC抑制DC细胞成熟的机制。在MSC与DC细胞及CD4+T细胞共培养体系中，MSC可抑制DC的抗原提呈功能，同时可抑制DC细胞对趋化因子CCL19的识别，进而影响DC细胞的迁徙能力［27］。Di等［28］证实，人骨髓MSC在与T淋巴细胞分隔培养的情况下，可通过转化生长因子-β1及肝细胞生长因子抑制T淋巴细胞增殖，而且细胞间接触可显著增强MSC抑制T细胞增殖的作用。可见，MSC对免疫应答过程发挥强有力的负性调控作用。调节性T细胞在体内发挥重要的免疫调节功能，亦是MSC发挥其功能的重要介质。MSC不但可以抑制DC细胞的成熟，而且诱导生成的不成熟DC细胞可通过分泌IL-10而诱导调节性T细胞扩增，进而实现免疫下调［29］。肺损伤伴失血性休克动物模型中，输注MSC可增加血液中调节性T细胞的比例，进而改善肺损伤预后［21］。在脓毒症动物模型中亦可观察到相同的现象［22］。

上述研究可见，MSC对脏器损伤的保护及免疫调节作用呈现出多节点、网络式的综合控制效应，与IRI多环节交错，结合其低免疫源性、易获取的固有优点，MSC在IRI治疗中极具潜在应用价值，前景广阔。早期研究表明，MSC在体外培养可诱导分化为肝细胞，Kuo等［30］进一步研究发现，肝衰竭模型中，不论是MSC诱导分化而来的肝细胞还是MSC，均可通过静脉输注而定植于肝脏内并分化为有功能的肝细胞缓解肝衰竭、促进肝细胞再生。目前研究结果多倾向于认为输注入体内的MSC分化作用有限，通过旁分泌作用促进肝再生的作用在IRI的治疗中可能占主导地位［31］。初步动物实验验证MSC可促进兔肝的再生，减少肝细胞及肝窦内皮细胞凋亡，抑制Kupffer细胞活化及白细胞浸润，调节炎症介质的释放，促进血管内皮细胞生长因子及基质金属蛋白酶-9合成，发挥对IRI肝脏的保护作用［32］。同样，在兔肝缺血模型中，MSC可抑制炎症反应、氧化应激及细胞凋亡而改善IRI［17］。可见，MSC对于肝脏损害具有明确的保护作用，且作用方式多样［33］。根据目前大量动物实验的良性结果，MSC初步的临床应用试验亦已逐步开展，非肿瘤患者中MSC临床应用的近期安全性已得到肯定，临床治疗IRI效果亦显著。因此，也对MSC治疗IRI机制的研究提出了更高的要求。目前，MSC的临床应用亦有一定的局限，研究发现MSC供体高龄、存在动脉粥样硬化或2型糖尿病均可影响MSC的免疫抑制活性［34］，对MSC的来源提出了一定的要求。同时，MSC在不同病因造成的肝损害中应用的时机，体内迁徙、分化、定植过程均有待进一步明确。MSC在体内发挥作用的时效及存活情况尚未明确，多次使用的时间间期的选取有一定的盲目性，随着研究的深入，这些问题均有望被解决。

综上所述，肝脏IRI目前缺乏有效的针对性治疗手段，MSC在肝脏IRI中的应用拓展了细胞治疗的应用范围，并为肝脏IRI的治疗提供了可能的治疗手段。

1 Maggi U， Fornoni G， Centonze L， et al. Ischemia time and liver transplantation， today［J］. Transplantation Proceedings， 2014，46（7）：2295-2299.

2 Sorensen KK， Simon-Santamaria J， Mccuskey RS， et al. Liver sinusoidal endothelial cells［J］. Compr Physiol， 2015， 5（4）：1751-1774.

3 Huet PM， Nagaoka MR， Desbiens G， et al. Sinusoidal endothelial cell and hepatocyte death following cold ischemia-warm reperfusion of the rat liver［J］. Hepatology， 2004， 39（4）：1110-1119.

4 Russo L， Gracia-Sancho J， Garcia-Caldero H， et al. Addition of simvastatin to cold storage solution prevents endothelial dysfunction in explanted rat livers［J］. Hepatology， 2012， 55（3）：921-930.

5 Selzner N， Liu H， Boehnert MU， et al. FGL2/fibroleukin mediates hepatic reperfusion injury by induction of sinusoidal endothelial cell and hepatocyte apoptosis in mice［J］. J Hepatol， 2012， 56（1）：153-159.

6 Huang H， Evankovich J， Yan W， et al. Endogenous histones function as alarmins in sterile inflammatory liver injury through Toll-like receptor 9 in mice［J］. Hepatology， 2011， 54（3）：999-1008.

7 Huang H， Tohme S， Al-Khafaji AB， et al. Damage-associated molecular pattern-activated neutrophil extracellular trap exacerbates sterile inflammatory liver injury［J］. Hepatology， 2015， 62（2）：600-614.

8 Matsumura F， Yamaguchi Y， Goto M， et al. Xanthine oxidase inhibition attenuates kupffer cell production of neutrophil chemoattractant following ischemia-reperfusion in rat liver［J］. Hepatology， 1998，28（6）：1578-1587.

9 Martens JC， Keilhoff G， Halangk W， et al. Lipidomic analysis of molecular cardiolipin species in livers exposed to ischemia/ reperfusion［J］. Mol Cell Biochem， 2015， 400（1-2）：253-263.

10 Sun J， Wu Q， Sun H， et al. Inhibition of histone deacetylase by butyrate protects rat liver from ischemic reperfusion injury［J］. Int J Mol Sci，2014， 15（11）：21069-21079.

11 Van der Hoeven JA， Lindell S， van Schilfgaarde R， et al. Donor brain death reduces survival after transplantation in rat livers preserved for 20 hr［J］. Transplantation， 2001， 72（10）：1632-1636.

12 Leal AJ， Tannuri AC， Belon AR， et al. Effects of ischemic preconditioning in a pig model of large-for-size liver transplantation［J］. Clinics， 2015， 70（2）：126-135.

13 Nastos C， Kalimeris K， Papoutsidakis N， et al. Global consequences of liver ischemia/reperfusion injury［J］. Oxid Med Cell Longev， 2014，2014：906965.

14 周丽娜，崔晓军，苏开鑫，等. 体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞向许旺细胞样细胞分化的研究［J］. 器官移植，2015（2）：105-110. 15 陈健琳，冯凯，郭子宽，等. 骨髓间充质干细胞抑制异体T淋巴细胞反应的实验研究［J］. 中华血液学杂志，2005，26（12）：740-742.

16 Consentius C， Reinke P， Volk H. Immunogenicity of allogeneic mesenchymal stromal cells： what has been seen in vitro and in vivo？［J］. Regenerative Medicine， 2015， 10（3）：305-315.

17 Saidi RF， Rajeshkumar B， Shariftabrizi A， et al. Human adiposederived mesenchymal stem cells attenuate liver ischemiareperfusion injury and promote liver regeneration［J］. Surgery， 2014，156（5）：1225-1231.

18 Consentius C， Akyuz L， Schmidt-Lucke JA， et al. Mesenchymal stromal cells prevent allostimulation in vivo and control checkpoints of Th1 priming： migration of human DC to lymph nodes and NK cell activation［J］. Stem Cells， 2015，33（10）：3087-3099

19 Van Linthout S， Stamm C， Schultheiss HP， et al. Mesenchymal stem cells and inflammatory cardiomyopathy： cardiac homing and beyond［J］. Cardiology Research and Practice， 2011， 2011：1-8.

20 Heldman AW， Difede DL， Fishman JE， et al. Transendocardial mesenchymal stem cells and mononuclear bone marrow cells for ischemic cardiomyopathy： the TAC-HFT randomized trial［J］. Jama，2014， 311（1）：62-73.

21 Gore AV， Bible LE， Song K， et al. Mesenchymal stem cells increase T-regulatory cells and improve healing following trauma and hemorrhagic shock［J］. J Trauma Acute Care Surg， 2015， 79（1）：48-52.

22 Chao YH， Wu HP， Wu KH， et al. An increase in CD3+CD4+CD25+ regulatory T cells after administration of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells during sepsis［J］. PLoS One， 2014， 9（10）：e110338.

23 Lucchini G， Introna M， Dander E， et al. Platelet-lysate-expanded mesenchymal stromal cells as a salvage therapy for severe resistant graft-versus-host disease in a pediatric population［J］. Biol Blood Marrow Transplant， 2010， 16（9）：1293-1301.

24 You Y， Zhang J， Gong J， et al. Mesenchymal stromal cell-dependent reprogramming of Kupffer cells is mediated by TNF-alpha and PGE2 and is crucial for liver transplant tolerance［J］. Immunol Res， 2015，62（3）：292-305.

25 Maggini J， Mirkin G， Bognanni I， et al. Mouse bone marrowderived mesenchymal stromal cells turn activated macrophages into a regulatory-like profile［J］. PLoS One， 2010， 5（2）：e9252.

26 Liu Y， Yin Z， Zhang R， et al. MSCs inhibit bone marrow-derived DC maturation and function through the release of TSG-6［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2014， 450（4）：1409-1415.

27 English K， Barry FP， Mahon BP. Murine mesenchymal stem cells suppress dendritic cell migration， maturation and antigen presentation［J］. Immunology Letters， 2008， 115（1）：50-58.

28 Di Nicola M， Carlo-Stella C， Magni M， et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli［J］. Blood， 2002， 99（10）：3838-3843.

29 Cahill EF， Tobin LM， Carty F， et al. Jagged-1 is required for the expansion of CD4+ CD25+ FoxP3+ regulatory T cells and tolerogenic dendritic cells by murine mesenchymal stromal cells［J］. Stem Cell Research & Therapy， 2015， 6（1）.

30 Kuo TK， Hung SP， Chuang CH， et al. Stem cell therapy for liver disease： parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells［J］. Gastroenterology， 2008， 134（7）：2111-2121，2121.

31 Fouraschen SM， Hall SR， de Jonge J， et al. Support of hepatic regeneration by trophic factors from liver-derived mesenchymal stromal/stem cells［J］. Methods Mol Biol， 2014， 1213：89-104.

32 Du Z， Wei C， Cheng K， et al. Mesenchymal stem cell-conditioned medium reduces liver injury and enhances regeneration in reduced-size rat liver transplantation［J］. J Surg Res， 2013， 183（2）：907-915.

33 周霞，韩英. 干细胞在肝脏疾病治疗中的临床应用及分子机制［J］.中华细胞与干细胞杂志（电子版），2015，5（2）：58-65.

34 Kizilay Mancini O， Shum-Tim D， Stochaj U， et al. Age， atherosclerosis and type 2 diabetes reduce human mesenchymal stromal cell-mediated T-cell suppression［J］. Stem Cell Research & Therapy， 2015， 6（1）：140.

Mesenchymal stem cell and liver ischemia-reperfusion injury

Li Shihui， Guo Yu， Yang Yang.Department of Liver Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Yang Yang， Email:yysysu@163.com

Ischemia-reperfusion injury （IRI）， common during liver surgery， can cause liver dysfunction and there is not effective treatment. The mechanism of IRI is complex. The uncontrolled inflammatory reaction， characterized by systematic disorder， plays a major role after the physical and chemical injury of the liver. The innate ability of mesenchymal stem cells to regulate immune system，which plays a crucial role in liver IRI， provides a potential therapy for this dysfunction. Mesenchymal stem cells have low immunogenicity and are easily accessible. All these features enable mesenchymal stem cells to be a potential treatment of liver IRI， which has been proved in many trials. Mesenchymal stem cells therapy is believed to have a promising future in curing liver IRI.

Mesenchymal stem cells； Reperfusion injury； Hepatopathy

2015-11-13）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.03.010

国家自然科学基金（81370575，81302550，81370555，81570593，81301331）；十二五重大科技专项（2012AA02A608，2012ZX10002010-001-007）；广东省自然科学基金（2015A030312013）；广州市健康医疗协同创新重大专项（158100076，201400000001-3）；中山大学5010项目（2014006）

510630 广州，中山大学附属第三医院肝脏外科

杨扬，Email：yysysu@163.com

李势辉， 郭宇， 杨扬. 间充质干细胞与肝缺血再灌注损伤［J/CD］. 中华细胞与干细胞杂志：电子版， 2016， 6（3）：191-194.