利福平对结核分枝杆菌在不同植入材料界面黏附力及生物膜形成的影响

赵志辉，王永清，熊庆广，毕红宾，孙晋保，李毅(天津医科大学第四中心临床学院，天津300140)

利福平对结核分枝杆菌在不同植入材料界面黏附力及生物膜形成的影响

赵志辉，王永清，熊庆广，毕红宾，孙晋保，李毅(天津医科大学第四中心临床学院，天津300140)

摘要:目的通过体外实验研究利福平对结核分枝杆菌(MTB)在不同植入材料界面黏附力及生物膜形成的影响。方法随机选取钴铬钼合金、钛合金、聚乙烯样品各两块分别置入3支离心管中，加入8mLmiddlebrook7H9液体培养基，再接种初始浓度为1010CFU/mL的MTB悬液2mL混匀，恒温(37℃)下培养30d，从每支离心管中，随机取出一块材料，经固定、干燥、喷金后，应用扫描电子显微镜观察，比较MTB对不同植入材料的黏附力，同时观察界面生物膜形成情况。然后每支离心管中加入2mL浓度为1 μg/mL的利福平溶液，同样条件下继续培养30d。取出材料块，经固定、干燥、喷金后，应用扫描电子显微镜观察，了解利福平对MTB黏附力的影响及对MTB生物膜的破坏情况。结果MTB对不同植入材料界面的黏附力由强到弱依次是聚乙烯、钴铬钼、钛合金;聚乙烯界面可见生物膜形成，钴铬钼合金、钛合金界面均未见生物膜形成;利福平干预后，植入物界面黏附的菌落数显著减少，聚乙烯界面生物膜呈不同程度破坏。结论利福平能抑制MTB对不同植入材料界面的黏附及生物膜形成。

关键词:结核分枝杆菌;利福平;细菌黏附;生物膜;植入物

Effects of rifampicin on adhesion ability and biofilm formation ofmycobacterium tuberculosis onto interfaces ofdifferent implantmaterials

ZHAO Zhi-hui，WANG Yong-qing，XIONG Qing-guang，BI Hong-bin，SUN Jin-bao，LI Yi(The Fourth Center Clinical College of Tianjinmedical University，Tianjin 300140，China)

Abstract:Objective To investigate the effects of rifampicin on the adhesion ability and biofilm formation ofmycobacterium tuberculosis(MTB)in vitro.Methods We each selected two samples of cobalt chromiummolybdenum alloy，titanium alloy and polyethylene and put them into 3 centrifuge tubes，respectively.Then，8mL ofmiddlebrook7H9 culturemedium and 2mL initial concentration of 1010cfu/mL of reinoculation ofmTB suspension liquid weremixed in centrifuge tubes and cultured under the constant temperature(37℃)for 30days.We randomly took out one sample from each centrifuge tube and used scanning electronmicroscope for observation after fixing，drying and spraying gold on it.Then，we compared the bioadhesion ability ofmTB ondifferent implantmaterials and at the same time we observed interface biofilm formation.After that，adding 2mL concentration of 1μg/mL of rifampicin solution into each centrifuge tube.Thirtydays of culturing under the same condition was performed and we took out the sample.After the same procedure with former samples they were observed by scanning electronmicroscope，we gained a better understanding of the effect of rifampicin on themTB adhesion force and thedamage tomTB biofilm.Results The adhesion ability to polyethylene was higher than those of titanium alloy and cobalt chromiummolybdenum alloy，and the adhesion ability with cobalt chromiummolybdenum alloy was higher than that of titanium alloy.No biofilm forms on the interface of cobalt chromiummolybdenum alloy and titanium alloy while it was available on the interface of polyethylene.After the rifampicin intervention，the number of colonies on the interface of implant reduced significantly，and the biofilm on the interface of polyethylene wasdestroyed to some extent.Conclusion Rifampicin can inhibit adhesion ability and biofilm formation ofmTB.

Key words:mycobacterium tuberculosis; rifampicin; bacterial adhesion; biofilms; implants

骨与关节结核是常见的肺外结核，其中脊柱结核约占50%［1］，髋膝关节结核占25%～35%［2］，骨关节结核发病率逐年上升［3～5］。骨结核引起的疼痛、骨质破坏、功能受限、截瘫等严重影响患者日常生活，给骨结核的治疗带来严峻挑战。外科手术是解除患者痛苦、重建功能、提高生活质量的可靠方法。1975年，Mironski等［6］报道一期病灶清除置入植入物治疗骨结核，但国内外学者将其视为活动性骨结核的禁忌。近年来，部分学者尝试一期病灶清除置入植入物治疗活动性骨结核，取得一定疗效［7～10］，但仍担心术后复发问题，其焦点主要集中于细菌生物膜。细菌黏附假体并形成生物膜，是假体周围感染持续不愈的重要原因［11］。研究［12，13］表明，结核分枝杆菌(MTB)对不同材料的黏附力不同，能在“液体－空气”界面形成生物膜［14］，但有关MTB黏附生物材料界面形成生物膜的情况尚未见报道，因此研究MTB对不同植入物材料的黏附性及生物膜形成情况对一期病灶清除置入植入物治疗活动性骨结核的安全性有重要意义。本研究采用液体培养基模拟MTB黏附植入物、形成生物膜的过程，并加入抗结核药利福平干预，通过扫描电子显微镜观察MTB在植入物界面的黏附及生物膜形成情况。现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1材料MTB标准株H37Rv由天津市疾控中心提供。生物安全柜、CO2恒温培养箱购自美国NUAIRE公司; CPD-030 CO2临界点干燥仪、SCD-005喷涂刻蚀仪购自瑞士BAL-TEC公司。FEI Quanta 200扫描电子显微镜(SEM)购自荷兰FEI公司。Middlebrook7H9液体培养基，利福平、戊二醛购自Sigma公司，四氧化锇购自SPI公司，乙酸异戊酯购自天津市科密欧化学试剂有限公司，磷酸缓冲液试剂、乙醇为国产分析醇; 50mL离心管购自Corning公司;钛合金、钴铬钼合金、聚乙烯材料由天津市金兴达有限公司提供，加工制成直径0.8 cm、厚0.2 cm圆片，经蒸馏水、洗涤界面污渍后高温高压消毒，备用。

1.2细菌悬液的准备选取生长良好的MTB标准株，用生理盐水稀释，振荡摇匀，配制成浓度约1011CFU/mL的菌液，以1∶10的比例将MTB菌液注入Middlebrook7H9液体培养基中，制成初始浓度为1010CFU/mL的细菌悬液备用。

1.3不同植入物界面MTB黏附力及生物膜形成观察随机选取钴铬钼合金、钛合金、聚乙烯样品各两块分别置入3支离心管中，加入8mLmiddlebrook7H9液体培养基，再接种上述MTB悬液2mL混匀，恒温(37℃)下培养30d，从每支离心管中，随机取出1块，然后在每支离心管中加入2mL浓度为1mg/mL的利福平溶液，同样条件下继续培养30d，实验重复10次。上述材料块无菌磷酸缓冲液(PBS)漂洗3次后，依次经3%戊二醛固定，1%四氧化锇固定，30%～100%乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，金离子溅射法镀膜处理，SEM观察MTB对植入物界面黏附及生物膜形成情况。放大500倍条件下，每块材料表面随机选取10个10 μm× 10 μm的视野，对黏附菌落进行计数。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量数据以珋x±s表示，利福平干预前不同植入物界面黏附的菌落数比较，行单因素方差分析和t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1植入物界面扫描电镜观察500倍视野下，聚乙烯界面可见MTB黏附，形成似“雪花状”的菌落，且部分菌落间已相互融合(A);放大至5 000倍，可见大量MTB聚集，成为立体的、复杂的膜样结构，MTB周围可见“膜状”黏液样物质，将细菌间连接起来(B)，对“膜下”的细菌起保护作用;在500倍视野下，钛合金和钴铬钼合金界面可见MTB黏附，并形成菌落，但菌落间未见融合现象(E、I);放大至15 000倍，钛合金和钴铬钼合金界面未见生物膜形成，MTB呈单个样黏附，彼此之间不发生聚集、粘连，有的已干瘪、裂解死亡(F、J)。利福平干预后，500倍视野下植入物界面黏附菌落数减少，甚至未黏附菌落(C、G、K);放大至5 000倍，MTB出现干瘪、裂解(H)，聚乙烯界面形成的生物膜有不同程度的破坏(D)。

2.2mTB在植入物界面黏附力比较利福平干预前，聚乙烯界面黏附的菌落数多于钴铬钼界面(P＜0.05);聚乙烯界面黏附的菌落数多于钛合金界面(P＜0.05);钴铬钼界面黏附的菌落数与钛合金界面比较差异无统计学意义(P＞0.05);利福平干预后，三种植入物界面黏附菌落数显著减少，差异均有统计学意义(表1)。

3　讨论

图1　植入物界面扫描电镜观察(×图500)

表1　利福平干预前后植入物界面黏附菌落数比较(个/视野，)

表1　利福平干预前后植入物界面黏附菌落数比较(个/视野，)

材料　菌落数量干预前　　干预后tP聚乙烯6.08±1.58　2.77±1.70　4.46　　＜0.05钴铬钼　2.16±1.24　0.93±0.56　2.85　　＜0.05钛合金1.57±0.52　0.55±0.41　4.86　　＜0.05

生物膜的形成分为细菌黏附、播散、胞外多聚物覆盖3个步骤。植入物置入后，立即被组织液、血液、蛋白质分子等包被，可逆性黏附植入物界面形成条件膜，之后细菌在范德华力、表面张力、静电作用等非特异性因素作用下，附着于条件膜［15］，这种附着易受体液的冲刷、机体免疫反应等作用被迁移。随后，特异性黏附分子开始介导这一过程，细菌表面特定的黏附素蛋白识别宿主界面相应受体［16］，牢靠黏附植入物界面。生物膜扩散、胞外多聚物覆盖同时进行，细菌黏附植入物界面相互聚集形成微菌落;细菌为适应环境，克隆、分泌大量多糖蛋白质复合物，形成复杂致密的生物膜结构，即成熟生物膜。

以往研究［12，13］表明，MTB对不同植入物的黏附力不同，但就其是否在植入物界面形成生物膜存在一定争议，而且这些研究均是将植入物置于固态或半固态培养基培养，MTB与植入物直接接触，与体内环境相比，存在一定的缺陷。本研究则采用液体培养基模拟MTB体内黏附植入物形成生物膜的过程，观察抗结核药干预前后MTB对不同植入物的黏附力及生物膜形成，期许阐明活动性骨结核一期置入植入物的安全性原因。

诸多学者对MTB在植入物界面的黏附力进行了探讨，各种不断改进的研究方法均证实MTB对不同植入物界面的黏附力不同，且大部分学者认为MTB对植入物的低黏附力是一期病灶清除内固定治疗脊柱结核安全的关键因素［17］。因此，本实验在沿用这些成熟方法的同时，在MTB培养30d后，加入利福平干预，探讨其对MTB黏附力和生物膜形成的影响。结果表明，MTB对聚乙烯、钴铬钼合金、钛合金的黏附力依次减弱，与以往同类研究［17］接近，笔者认为其可能与植入物界面的化学组成、自由能、表面电荷等有关;亦有研究者认为是植入物界面的凹陷增加了细菌与植入物界面间的局部摩擦力，同时亦增加了植入物界面局部的表面张力，使细菌更易黏附于凹陷处［12］;凹陷的存在亦为MTB的黏附提供了一定的“优势”部位，一定程度上可防止细菌被流体物质冲刷，因此本研究不排除是植入物材料性质和植入物的界面状态综合作用的结果。该研究结果进一步证实，MTB对骨科植入材料的低黏附力是活动性骨结核一期置入植入物安全的重要原因。

目前，就MTB是否在骨科植入物界面形成生物膜意见尚不统一。综合分析国内外文献与前期基础研究［18］，笔者认为MTB在骨科植入物界面能形成生物膜。扫描电子显微镜观察结果表明，MTB能在聚乙烯界面见生物膜形成，在钛合金、钴铬钼界面不形成生物膜，推测可能与植入物的生物相容性有关，植入物腐蚀释放的离子对MTB有毒性作用，这种毒性刺激MTB，使其以极其精确、协调的步骤启动或关闭特定的基因表达，克隆、分泌大量多糖-蛋白质复合物，并形成生物膜［19］。既往研究证明细菌黏附是生物膜的前提，是细菌表面特定的黏附素蛋白识别宿主表面受体的结果［16］，因此MTB在植入物界面生物膜的形成具有选择性和特异性。本研究结果能为MTB在植入物界面生物膜形成的基础研究提供方向。

近年来，骨结核术后复发有增加趋势，其主要原因可能是病灶残留MTB死灰复燃的结果。由于病灶周围血供减小、硬化骨的存在，病灶残留MTB黏附植入物，形成生物膜的机会明显增加，且容易耐药，这对骨结核的治疗是灾难性的;全身抗结核治疗往往不够，常需联合局部抗结核治疗，才能达到理想的杀菌或抑菌浓度。本实验结果表明，利福平干预后，植入物界面黏附的菌落数显著减少，差异有统计学意义，且聚乙烯界面的生物膜有不同程度的破坏，表明利福平能抑制MTB的黏附及生物膜形成，因此植入物的存在不影响抗结核药物对MTB的杀灭效果，局部抗结核治疗在活动性骨结核一期置入植入物中具有重要作用。

研究［20］证实利福平可抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。本研究发现，利福平干预后，部分MTB出现干瘪、裂解，细菌的堆积变得更松散，生物膜有不同程度的破坏，表明利福平能破坏生物膜。药物攻击结核生物膜表层菌并在膜上产生裂隙，使更多的药物渗入生物膜深层，从而提高药物的抗菌作用，但这仅仅是基于形态上的猜测，还有待进一步证实。

现今，常用的骨科植入物主要由钴铬钼、钛合金、聚乙烯、陶瓷、骨水泥等材料制成，对结核病灶置入的植入物无统一标准，但均倾向于选择生物相容性好、稳定性好的材料。研究证实，细菌对生物材料的黏附性及生物膜形成受植入物材料的影响;植入物溶解或磨损时产生的离子或碎屑导致局部不良的软组织反应和破坏［21］，调节免疫系统和细菌生长［22］，为残留结核杆菌的死灰复燃和繁殖创造条件。王永清等［10］认为植入物生物相容性越好，细菌的黏附性越差，形成生物膜的概率越小;因此，骨结核病灶置入植入物时，应选择生物相容性好，MTB对其黏附性差，不形成生物膜的植入材料。本研究表明MTB对钛合金、钴铬钼材料的黏附性差，且不形成生物膜，是用于骨结核病灶置入材料的可靠选择;虽然聚乙烯界面有生物膜形成，但利福平能够破坏其生物膜，故亦可安全置入病灶内。

本研究尚存在一定的局限性，未设置对照组，无法与其他细菌进行比较，因此我们无法给出MTB与普通细菌黏附力强弱的比较。

综上所述，MTB对钛合金、钴铬钼材料的黏附性差，且不形成生物膜，是用于骨结核病灶置入材料的可靠选择;利福平能抑制MTB的黏附及生物膜形成，认为在选择性应用植入物和局部抗结核的前提下，活动性骨结核一期置入植入物安全可行，植入物的存在不会增加骨结核术后复发风险。

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·基础研究·

收稿日期:( 2015-04-14)

通信作者简介:王永清(1962-)，主任医师，博士，主要研究方向为骨与关节疾病。E-mail: 13820789626@139.com

作者简介:第一赵志辉(1981-)，主治医师，硕士研究生在读，主要研究方向为骨与关节疾病。E-mail: zhaozhihui0929@126.com

基金项目:天津市卫生局科技基金面上项目(2013KY05)。

文章编号:1002-266X(2015)33-0021-04

文献标志码:A

中图分类号:R52

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.007