替莫唑胺、紫杉醇对神经胶质瘤U87细胞增殖的联合作用效果观察

梁会娟，梁海乾，涂悦，程世翔，周欣，姬文杰，魏向阳，苏景良，张赛( 天津医科大学研究生院，天津300070;武警后勤学院附属医院)

替莫唑胺、紫杉醇对神经胶质瘤U87细胞增殖的联合作用效果观察

梁会娟1，梁海乾2，涂悦2，程世翔2，周欣2，姬文杰2，魏向阳2，苏景良2，张赛2
( 1天津医科大学研究生院，天津300070;2武警后勤学院附属医院)

摘要:目的探讨替莫唑胺( TMZ)、紫杉醇( PTX)对神经胶质瘤U87细胞增殖的联合作用效果。方法将不同浓度的PTX或TMZ作用U87细胞24 h，确定两药的半数抑菌浓度( IC50)。PTX( IC50)、TMZ( IC50)单药及联合作用于体外培养神经胶质瘤U87细胞24、48、72 h，采用CCK-8试剂盒检测各时间点细胞生长抑制率。结果PTX的IC50为0.5 ng/mL，TMZ的IC50为5 μg/mL。与PTX或TMZ单药作用24、48 h比较，PTX + TMZ作用下细胞生长抑制率均降低( P均＜0.01) ;与TMZ单药作用72 h比较，PTX + TMZ作用下细胞生长抑制率升高( P＜0.05)。结论

TMZ联合PTX作用于神经胶质瘤U87细胞48 h内，两药表现为拮抗作用。作用72 h，与TMZ单药作用相比，两药联合有协同作用;但与PTX单药比较，该协同作用不明显。

关键词:神经胶质瘤;替莫唑胺;紫杉醇;协同作用;拮抗作用

神经胶质瘤是脑部最常见的恶性肿瘤［1］，目前主要采用手术同步放化疗方案治疗，但总体有效率不高。替莫唑胺( TMZ)为胶质瘤化疗方案中一线用药，但随着治疗时间的延长，其疗效降低，耐药现象严重。紫杉醇( PTX)曾广泛应用于乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等治疗，但长期用药出现的剂量相关的毒性反应及过敏现象严重。研究发现，TMZ、PTX耐药均与p53有关［2，3］。但两药联合是否能够发挥协同作用，目前尚不确定。2012年10月～2013年1月，本研究观察了TMZ、PTX对神经胶质瘤U87细胞增殖的联合作用效果。

1　材料与方法

1.1材料神经胶质瘤U87细胞(天津医科大学总医院)，DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，PTX、TMZ(美国Sigma公司)，CCK-8试剂盒(武汉博士德公司)。

1.2细胞培养U87细胞在含10%胎牛血清的HDMEM培养基中，置于5% CO2、37℃培养箱中培养;以0.25%胰蛋白酶消化传代，2～3 d传代1次。

1.3 TMZ、PTX半数抑菌浓度( IC50)确定及细胞增殖情况检测①IC50确定:取对数生长期U87细胞，按1×103/孔接种于96孔培养板。培养24 h后，加入配置好的不同浓度PTX( 1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 ng/mL)或TMZ( 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg/mL)处理细胞24 h。每个浓度设5个复孔。5% CO2、37℃培养箱中共培养24 h后，每孔加入CCK-8溶液( 5 mg/mL) 10 μL，使终体积达到100 μL，移入37℃孵箱中继续孵育1 h。以仅含U87细胞孔为对照孔，仅含培养液孔为空白孔。采用全自动酶标仪，在波长450 nm下测定每孔光密度( OD)值，计算细胞生长抑制率。生长抑制率( %) = ( OD对照－OD药物)/( OD对照－OD空白)× 100%。采用SPSS11.0统计软件推算PTX、TMZ的IC50。②细胞生长抑制率计算:以1×103/孔接种细胞于96孔培养板，培养24 h，分别加入PTX、TMZ、PTX + TMZ处理细胞，PTX、TMZ浓度均为IC50。每个浓度设5个复孔。5% CO2、37℃培养箱中共培养24、48、72 h后，每孔加入CCK-8溶液( 5 mg/mL) 10 μL，使终体积达到100 μL，移入37℃孵箱中继续孵育1 h。采用全自动酶标仪在波长450 nm下测定每孔OD值，计算细胞生长抑制率。

1.4统计学方法采用SPSS11.0统计软件。计量资料采用珋x±s表示，比较采用配对t检验(双侧)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

PTX的IC50为0.5 ng/mL，TMZ的IC50为5 μg/mL。PTX、TMZ、PTX + TMZ作用24、48、72 h后细胞生长抑制率比较见表1。

3　讨论

TMZ、PTX是胶质瘤术后临床常用化疗药物。PTX是一种水溶性分子，在胞外以被动扩散的形式通过细胞膜作用于微管系统，通过与微管蛋白N端

31位和217～231位氨基酸结合，诱导和稳定微管蛋白，使细胞周期阻滞于G2/M期［4］，诱导细胞凋亡。TMZ是一种脂溶性药物，它是一种前体药物，在体内不需要经过肝脏代谢，正常生理条件下即可经过非酶解途径转化为活性化合物，直接发挥甲基化DNA的作用，使细胞周期停滞于G2期［5］。

表1　 PTX、TMZ、PTX + TMZ作用24、48、72 h细胞生长抑制率比较( %，±s)

表1　 PTX、TMZ、PTX + TMZ作用24、48、72 h细胞生长抑制率比较( %，±s)

注:与TMZ或PTX单独作用24 h比较，*P＜0.01;与TMZ或PTX单独作用48 h比较，#P＜0.01;与TMZ单独作用72 h比较，▲P ＜0.05。

药物　生长抑制率24 h　48 h　72 h TMZ　0.83±0.04　0.78±0.01　0.67±0.04 PTX　0.50±0.01　0.87±0.04　0.72±0.01 PTX +TMZ　 0.25±0.01* #　0.20±0.01* #　0.74±0.01▲

本研究中PTX的IC50为0.5 ng/mL、TMZ的IC50为5 μg/mL，5 μg/mL TMZ作用24 h的细胞生长抑制率较0.5 ng/mL PTX大。产生机制:①TMZ 比PTX的细胞外浓度高，膜内外浓度梯度大，渗透作用更强;②TMZ直接作用于DNA，发挥杀伤作用; PTX不能直接作用于DNA，而是首先作用于微管系统，进一步诱导Raf-1的级联反应，进而发挥促凋亡作用［6］。

PTX进入细胞以后，诱导Raf-1/Bcl-2磷酸化，其丝氨酸的270位点被认为是PTX诱导Bcl-2磷酸化的主要位点，该位点被丙氨酸取代后，显著抑制Bcl-2、上调p53［7］。TMZ发生甲基化作用后，O6-甲基鸟嘌呤( O6-mG)主要被MGMT修复，N3甲基腺嘌呤、N7甲基鸟嘌呤主要被N7甲基鸟嘌呤-N3-甲基腺嘌呤-DNA-转葡糖激酶( MPG)修复，是细胞内碱基切除修复途径( BER)的始动因素，且不依赖于MGMT的存在。TMZ还可作用于葡萄糖调节蛋白78 ( GRP78)，它能够维持肿瘤细胞内内质网的稳定性，抵抗TMZ诱导的凋亡［8］。研究表明，MPG和MGMT均可上调p53［9］。在G1期，p53可以调控p21WAF/C1P1基因，与一系列Cyclin-cdk复合物结合，抑制蛋白激酶激活，使高磷酸化的Rb蛋白堆积，引起E2F转录调节因子抑制，细胞阻滞在G1期［10］;在G2/M期，p53通过下调Cyclin B1，使细胞不能进入M期［11］;最终导致细胞生长停滞，修复损伤，减少凋亡率。在p53的多聚体中，存在有能够和DNA结合的结构域，这些结构域本身具有核酸内切酶的活性，可以修复错配的核苷酸，调节核苷酸的内切修复因子XPB和XPD活性;此外，它还可以通过与P21WAF1基因以及CDK1基因结合，调节细胞周期进展［12］。

本研究发现，TMZ联合PTX作用于神经胶质瘤U87细胞48 h内，两药表现为拮抗作用。作用72 h时，与TMZ单药作用相比，两药联合有协同作用;但与PTX单药比较，该协同作用不明显。但是，本研究未观察两药联用的不良发应，今后将进一步探讨。

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·临床研究·

收稿日期:( 2014-10-24)

文章编号:1002-266X( 2015) 28-0034-02

文献标志码:A

中图分类号:R739.4

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.012