三向连接构造组合引物介导的滚环扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立

周敏，张宏萍，陆仁飞，李雪梅( 南通市疾病预防控制中心，江苏南通600;南通市第三人民医院)

三向连接构造组合引物介导的滚环扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立

周敏1，张宏萍1，陆仁飞2，李雪梅2
( 1南通市疾病预防控制中心，江苏南通226001;2南通市第三人民医院)

摘要:目的建立三向连接构造( 3WJ)组合引物介导的滚环扩增( PG-RCA)技术检测肠道病毒71型( EV71)的方法，并验证其检测效果。方法根据EV71的VP1基因保守区设计引物模板、引物以及环状探针前体，确立反应体系及反应条件，实时荧光PCR仪监测扩增结果。采用已建立的3WJ组合PG-RCA技术检测16例手足口病患儿咽拭子标本( EV71阳性12例、柯萨奇病毒A阳性2例、柯萨奇病毒B阳性2例)。结果已建立的3WJ组合PG-RCA技术能检测到amol级的EV71 RNA，说明方法建立成功。EV71阳性标本扩增曲线荧光强度均超过阈值;柯萨奇病毒A、B阳性标本扩增曲线荧光强度均低于阈值。结论成功建立3WJ组合PG-RCA技术检测EV71的方法，检测效果好。

关键词:肠道病毒71型;恒温扩增;滚环扩增;三向连接

Establishment of three-way junction formation and primer generation-rolling circle amplification for detection of EV71

ZHOU Min1，ZHANG Hong-ping，LU Ren-fei，LI Xue-mei
( 1 Nantong Center for Diseases Control and Prevention，Nantong 226001，China)

Abstract:Objective To establish a method of combining three-way junction ( 3WJ) formation and primer generation-rolling circle amplification ( PG-RCA) for the detection of enterovirus 71 ( EV71) and to verify its detection effect.Methods According to conservative EV71 VP1 gene，we designed template of primer，primer and circular probe precursor to detect EV71 with an isothermal reaction format.Real-time fluorescence PCR was used to detect the amplification.Using the established 3WJ combined with PG-RCA technology to detect the pharyngeal swab specimens in 16 cases of children with hand，foot and mouth disease ( 12 cases of positive EV71，2 cases of positive coxsackie virus A and 2 cases of positive coxsackie virus B).Results The 3WJ combined PG-RCA technology could detect the amol level of synthetic EV71 RNA.The detection method had good specificity and sensitivity.The amplification curve fluorescence intensity of EV71 positive specimens was stronger than the threshold，and the amplification curve fluorescence intensity of Coxsackie virus A and B positive specimen was lower than the threshold.Conclusion The 3WJ combined PG-RCA technology is established successfully with good detection effect.

Key words:enterovirus 71; isothermal amplification; rolling circle amplification; three-way junction

肠道病毒71型( EV71)属小RNA病毒科、肠道病毒属成员，是引起婴幼儿手足口病的主要病原体，对中枢神经系统有极高的感染性，重症患者比例明显高于其他肠道病毒，在世界范围内已引起10余次的暴发和流行［1，2］。常规的EV71诊断技术包括免疫学方法、病毒分离培养、PCR方法等，但大多存在难以早期诊断或敏感性、特异性低等缺陷。2011年日本学者Murakmi等发明了一种新的RNA恒温扩增技术，即三向连接构造( 3WJ)组合引物介导的滚环扩增( PG-RCA)技术，该技术是一种信号放大技术，可以检测到amol( 10-18mol)级的RNA［3～7］。本研究根据EV71 VP1基因区保守序列设计了一套引

物模板、引物以及环状探针，优化反应条件，建立3WJ组合PG-RCA技术检测EV71的方法，并验证其检测效果。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料及试剂收集2003年8月～2004年9月手足口病患儿咽拭子标本16例，其中EV71阳性样本12例、柯萨奇病毒A( CoxA)阳性标本2例、柯萨奇病毒B ( CoxB)阳性标本2例，均经实时荧光定量法检测阳性以及测序验证。以上标本均由南通市疾病预防控制中心微生物科提供。Vent( exo-) DNA聚合酶、Nb.BsmIQ、外切酶Ⅲ、ssRNA Ladder Mark ( NEB)、Circligase ssDNA ligase，购自外切酶ⅠEpicentre Biotechnologies，引物及探针由上海捷瑞生物公司合成。

1.2 3WJ组合PG-RCA检测EV71技术的建立

1.2.1靶序列、引物模板、引物及探针的设计NCBI搜索20个EV71 VP1基因序列，对20条序列进行比对，在其保守区选取66个碱基的保守序列作为靶序列，命名为RNA71，同时根据RNA71序列设计引物模板、引物、环状探针前体;见表1。

表1　 EV71的靶序列、模板、引物及环状探针

1.2.2环状探针的建立20 mmol/L环状探针前体、200 U Circligase ssDNA、10×连接酶缓冲液，ddH2O补充体积至20 μL，60℃恒温3 h;在反应体系内加入10 U外切酶Ⅰ和100 U外切酶Ⅲ，37℃消化过夜。反应产物经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化2次，回收环状探针，并经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.2.3 RNA71扩增条件的确立将RNA71配比成5个10倍梯度稀释，即2.5×10-14、2.5×10-13、2.5×10-12、2.5×10-11、2.5×10-10mol/L。3WJ反应体系5 μL，即RNA71( 5个浓度分别进行实验)、1 nmol/L引物模板、1 nmol/L引物，1×Vent( exo-) DNA聚合酶缓冲液补足5 μL; 80℃变性3 min， 37℃退火30 min。再加入0.8 μmol/L dNTP、15 nmol/L环状探针、0.05 U Vent( exo-) DNA聚合酶、1 U Nb.BsmI，1×Vent( exo-) DNA聚合酶缓冲液补足5 μL; 60℃恒温扩增。ABI7500实时荧光PCR仪监测3 h。

1.3临床标本检测12例EV71、2例CoxA、2例CoxB标本均采用磁珠法提取病毒RNA，－80℃冻存备用。采用3WJ组合PG-RCA技术检测EV71。反应体系: 0.5 μL标本RNA、1 nmol/L引物模板、1 nmol/L引物、1×Vent( exo-) DNA聚合酶缓冲液补足5 μL。反应条件: 80℃变性3 min，37℃退火90 min。再加入0.8 μmol/L dNTP、15 nmol/L环状探针、0.05 U Vent( exo-) DNA聚合酶、1 U Nb.BsmI，1 ×Vent( exo-) DNA聚合酶缓冲液补足5 μL; 60℃恒温扩增。ABI7500实时荧光PCR仪监测3 h，观察反应荧光强度。

2　结果

2.1 3WJ组合PG-RCA检测EV71技术的建立在100 bp左右获得1个清晰的条带，即环状探针，见图1。5个10倍梯度稀释的RNA71经3WJ组合PG-RCA技术恒温扩增后，ABI7500实时荧光PCR仪实时监测结果显示，扩增曲线按浓度高低依次超过阈值，见插页Ⅰ图1。

图1　15%聚丙烯酰胺凝胶电泳回收的环状探针

2.2临床标本检测结果12例EV71阳性临床标本扩增曲线荧光强度超过阈值; 2例CoxA、2例CoxB阳性临床标本扩增曲线荧光强度低于阈值; 2份阴性对照临床标本扩增曲线荧光强度低于阈值。见插页Ⅰ图2。

3　讨论

手足口病是指手、足、口腔等部位出现红色斑丘疹，伴有或不伴有发热的一种急性传染病，可由多种肠道病毒感染引起，如EV71、CoxA、CoxB、埃可病毒

等。EV71感染可出现严重的中枢神经系统并发症，CoxA16感染一般不合并严重并发症［8～12］。临床上对手足口病患儿感染的病原体进行早期诊断，尤其是EV71的鉴别诊断对其预后尤为关键。但是，对于条件相对落后的基层卫生中心来说，由于设备和技术人员的限制，很难及时监测和检测EV71; 且EV71是RNA病毒，运送标本过程中极易降解或污染。因此，寻找简便易行的EV71检测方法尤为重要［13～16］。

随着分子生物学技术的迅速发展，新的核酸扩增技术不断出现。3WJ组合PG-RCA技术是一种改良的PG-RCA方法，其特点是根据靶基因序列设计引物模板、引物、环状探针，三者两两杂交形成一个三向立体结构3WJ，产生信号引物;产生的信号引物通过引物介导的PG-RCA进一步放大信号引物;利用SYBR GreenⅠ染料作为显示系统，可以实时检测扩增结果。本研究首先建立3WJ组合PG-RCA技术检测EV71的方法，然后证明了该方法可以对手足口病患儿咽拭子标本中的EV71进行鉴别诊断。本研究合成了1个50个碱基长的EV71基因片段RNA71，利用3WJ组合PG-RCA技术对RNA71不同稀释度的检测发现，该技术能检测到低至amol级的EV71 RNA，说明该方法的扩增效率更高。与常规检测EV71的RT-PCR方法相比，3WJ组合PGRCA技术具备以下优点:①操作简单、步骤少，实验前一次性加完所有试剂; RT-PCR方法需逆转录及PCR两个实验才能完成检测。②不需要昂贵温控PCR设备，只需1个恒温设备和1个信号收集设备(虽然本实验利用了实时荧光PCR仪，但我们仅利用了仪器的恒温及收集荧光的功能) ; RT-PCR方法需要精密的实时荧光PCR仪，对操作分析人员技术要求较高。③本检测方法不开盖，扩增的单链引物片段易降解，大大降低了普通PCR过程中的污染概率。

总之，本研究成功建立了3WJ组合PG-RCA技术检测EV71的方法，检测效果好。

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·基础研究·

收稿日期:( 2015-01-04)

通信作者简介:张宏萍( 1968-)，主管技师，主要研究方向为医学微生物。E-mail: rainman78@163.com

作者简介:第一周敏( 1978-)，主管技师，主要研究方向为医学微生物。E-mail: teddy76@ sina.com

基金项目:江苏省南通市科技项目( HS2013028) ;江苏省南通市卫生局资助项目( W201224)。

文章编号:1002-266X( 2015) 28-0021-03

文献标志码:A

中图分类号:R446.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.007