微量热法研究壳聚糖铜对核桃内生菌生长代谢的影响

胡　帆,罗晓洁,刘玉青,卢　垚,夏彩芬

(湖北工程学院 化学与材料科学学院,湖北 孝感 432000)

微量热法研究壳聚糖铜对核桃内生菌生长代谢的影响

胡帆,罗晓洁,刘玉青,卢垚,夏彩芬*

(湖北工程学院 化学与材料科学学院,湖北 孝感 432000)

摘要：使用加热回流方式制备了配合物壳聚糖铜(CTS-Cu)，采用红外光谱法和原子吸收光谱法对配合物进行了表征，结果表明CTS中的-OH与-NH2可能参与了配位。采用原子吸收光谱法测定CTS-Cu溶液中Cu2+的含量，同时利用等温微量热方法研究了CTS-Cu、Cu2+和CTS分别对核桃内生菌(XRS107)生长代谢的影响，测定结果表明CTS-Cu参与了对XRS107的生长代谢过程，并对XRS107的生长代谢过程的影响表现出“低浓度刺激，高浓度抑制”的特征，而Cu2+和CTS对XRS107的生长代谢过程无明显影响。光密度法研究结果表明，经不同浓度CTS-Cu作用后，XRS107的光密度值(OD)表现出先增大后减小的趋势。

关键词：壳聚糖铜(CTS-Cu)；核桃内生菌(XRS107)；红外光谱法；微量热法

中图分类号：TS255.3

文献标志码：码：A

文章编号：号：2095-4824(2015)06-0011-05

收稿日期：2015-09-13

作者简介：胡帆(1995- )，男，湖北汉川人，湖北工程学院化学与材料科学学院学生。

通信作者夏彩芬(1979- )，女，湖北武汉人，湖北工程学院化学与材料科学学院讲师，博士，本文。

Abstract：In this paper, CTS-Cu was prepared by heating reflux, and the complex was analyzed by FTIR and AAS. The results showed -OH and -NH2could be involved in the coordination. The content of Cu2+in complex was calculated by AAS. Furthermore, the metabolism of walnut endophytes (XRS107) with CTS-Cu, Cu2+and CTS were detected by isothermal microcalorimetric method respectively. The results showed that the complex CTS-Cu was involved in the metabolic process of XRS107. In the CTS-Cu concentration range, the effect on the growth of XRS107 showed the characteristics of Hormesisi effect, while Cu2+and CTS had no obvious influence on XRS107 growth metabolism. In addition, the values of optical density(OD) of XRS107 was evaluated with low concentrations of CTS-Cu, and was dropped with high concentrations of CTS-Cu.

壳聚糖(Chitosan, CTS)是甲壳素脱乙酰基后的产物，主要存在于虾、蟹、昆虫等动物外壳及藻类植物、菌类的细胞壁中，为天然多糖中唯一的碱性多糖[1]。从分子结构上看，壳聚糖分子内含有大量的-NH2、-OH等典型的Lewis碱性配位基团，从构象上看都是平伏键，这种特殊的结构使它们对具有一定离子半径的某些金属离子具有很强的螯合作用[2-5]。

微量热法运用于抗菌药物的研究不但具有高灵敏度、高准确度、重复性好、操作方便等优点，而且能够实现连续、实时、原位、定量的测量与分析，从而获取丰富的热力学与热动力学信息、定量构效关系、甚至抗菌药物的作用机制等信息。而且该方法对水溶性不好的样品同样适用，这有利于将抗菌药物的筛选范围扩大，大大提高了先导化合物发现的机会[6-8]。大量的研究结果证实：壳聚糖及其衍生物具有广谱的抗菌性能，可抑制多种细菌和真菌的生长，壳聚糖金属配合物就是这样一种具有特殊抑菌性的壳聚糖基衍生物[9-12]。据此，本实验中拟制备壳聚糖铜(CTS-Cu)配合物，并采用美国TA公司的八通道微量热仪研究其对核桃内生菌的作用效果，旨在为明确壳聚糖金属配合物的抑菌机理提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验试剂与仪器

表1是实验所用的主要试剂。

表1　实验试剂

表2是实验所用的主要仪器。

1.2实验方法

1.2.1CTS-Cu的制备

将CTS和CuCl2·5H2O溶于50 mL的无水乙醇中，加入瓷子，加热回流24 h，冷却至室温后，用无水乙醇洗涤，减压抽滤，待滤液中无铜离子后，真空干燥成淡绿色晶体即可。

表2　实验仪器

1.2.2红外光谱法

利用傅里叶红外光谱仪分别测试CTS和CTS-Cu，并对二者图谱进行分析。

1.2.3原子吸收法

配制CTS-Cu溶液，利用原子分光光度计测试溶液中Cu2+的含量。

1.2.4微量热实验

XRS107的代谢产热过程由TAM air八通道恒温微量热仪系统监测，该系统采用安瓿法进行测定，仪器灵敏度为±200 nW。实验中，取TAM air 检测系统配套的安瓿瓶8个，分别加入等量的XRS107及一定浓度梯度的CTS-Cu溶液，并以空白LB培养基补充至5 mL，严密封盖后吊入量热通道，将量热系统温度控制为28 ℃，等系统稳定后,实时记录不同浓度的CTS-Cu作用下XRS107代谢产热数据。所有量热实验中的XRS107均为低温冰箱内保存约10 h后才进行使用。

1.2.5光密度法

配制不同CTS-Cu浓度作用下的XRS107菌悬液，采用紫外光谱仪，测定每个样的OD600值(光密度值)。

2分析与讨论

2.1配合物的表征

图1是CTS(A)和CTS-Cu(B)的红外光谱图。由图1知，曲线A与B十分相似，但是曲线A在3 423.4 cm-1处由-OH与-NH2的缔合伸缩振动吸收峰，在曲线B中移至3 438.9 cm-1处。同时，曲线A在1 654.6 cm-1处酰胺键中的C=O吸收峰，在曲线B移至1 633.7 cm-1处，表明CTS中的-OH与-NH2可能参与了配位。

图1　CTS(A)和CTS-Cu(B)的红外光谱图

图2是Cu2+原子吸收标准曲线，由图2标准曲线可知，实验测出CTS-Cu中的Cu2+的含量为14.1%。由此可以得出1.5 g/L CTS-Cu中的Cu2+的含量为0.211 5 g/L。

图2　Cu2+原子吸收标准曲线

2.2微量热法测定CTS-Cu对XRS107生长代谢的影响

2.2.1 XRS107在CTS-Cu作用下的产热曲线

在正常生理条件下，XRS107利用营养底物，通过基质中的LB培养基进行有氧呼吸作用，转化为ATP供细胞正常新陈代谢。本实验中选用XRS107作为实验生物材料，经梯度离心提纯后分析不同浓度CTS-Cu作用下XRS107的体外代谢产热情况，结果如图3所示。

恒温条件下，使用XRS107和LB培养基时(即为对照组)，XRS107存在明显的产热效应，说明XRS107仍可进行一些生物氧化反应，借助营养底物维持XRS107基本物质代谢。由图3(a)可知，在只有底物存在情况下XRS107产热曲线可分为四个阶段，即活性停滞期、恢复期、稳定期和衰亡期。从图3(b)可见，由于CTS-Cu的存在，使XRS107能量释放一开始停滞，在热谱图上表现为一段很平的线段，然后恢复生长，出现一段快速上升的曲线，且呈现出对数增长趋势。紧接着进入能量释放的稳定期，最后由于营养物和安瓿瓶中氧气逐渐耗尽，其能量释放进入衰竭期，图谱上产热曲线表现为逐渐下降趋势。

(a)XRS107

(b)CTS-Cu和XRS107

由以上实验结果可以推测，低浓度的CTS-Cu可以刺激XRS107代谢过程，最大产热功率随着浓度的增加而升高，高浓度的CTS-Cu则表现出明显的抑制效应，最大产热功率随着浓度的进一步增加而减小，甚至使得XRS107本身受损，在外加营养底物的情况下，仍然无法进行代谢。

2.2.2速率常数和最大产热功率

为定量地阐明浓度对XRS107代谢产热过程的影响，可以借助热动力学方法进行分析比较[13-14]。由图4可知，在活性恢复期，XRS107代谢产热曲线符合指数变化规律，即其代谢产热的动力学曲线遵循指数变化规律。P0和Pt分别为t=0和t时刻的热功率，则活性恢复期XRS107代谢热动力学方程为：

Pt=P0expkt或lnPt=lnP0+ kt

(1)

在活性恢复期，不同浓度CTS-Cu作用下XRS107代谢过程中的活性恢复期呈指数衰减模式。因此，根据上述方程，对活性恢复期的产热功率取自然对数，并与相应的时间作图，根据图3中的XRS107热效应曲线图和图4中得到的XRS107代谢k-c曲线，发现低浓度CTS-Cu对XRS107的代谢产热作用在活性恢复期具有促进作用。为进一步确证上述结果，在0 ～ 1.05 g/L CTS-Cu作用下，对活性恢复期速率常数k与对应的CTS-Cu浓度作图，发现当XRS107中加入的CTS-Cu的浓度从0增至0.30 g/L时，活性恢复期速率常数也逐渐增加，当CTS-Cu浓度为0.30 g/L时，增至最大值作为0.014 min-1，也就是说，低浓度(0～0.30 g/L)CTS-Cu明显刺激了XRS107代谢产热过程，随着CTS-Cu的浓度进一步增大，k则表现出减小趋势，即高浓度(0.60～1.05 g/L)的CTS-Cu显著抑制了XRS的代谢过程。

图4　XRS107在CTS-Cu作用下k-c曲线

图5　XRS107在CTS-Cu的作用下Q-c关系图

不同浓度CTS-Cu对XRS107代谢过程总产热量Q的影响如图5所示。与CTS-Cu对最大产热功率Pm的影响不同的是，在实验浓度范围含量内，CTS-Cu的加入对总产热量没有明显影响。与对照组总产热量相比，尽管不同含量CTS-Cu的加入会使得XRS107代谢总热略有变化，但其数值基本不变，表明CTS-Cu虽然参与了XRS107代谢过程，但由于每个XRS107代谢系统中含有相同量的XRS107、营养底物和空气，因而总产热量差别不大。

2.3光密度法(OD)

图6　XRS-107在CTS-Cu作用下的OD600柱形图

由图6结果可以推测,经不同浓度CTS-Cu温育10 h后，随着CTS-Cu浓度升高，XRS107的光密度值(OD)表现出先增大后减小的趋势。

2.4微量热法测定CTS和Cu2+对XRS107生长代谢的影响

2.4.1产热曲线

检测以LB培养基作为代谢底物的XRS107在不同浓度CTS和Cu2+作用下的体外代谢产热情况，实验结果如图7所示。

图7　XRS107在CTS作用下生长代谢产热曲线

可以看出，不同浓度的CTS对XRS107的生长代谢没有明显的影响(同样Cu2+对XRS107的代谢产热曲线也没有明显影响，图中未给出)。

2.4.2热动力学参数

表3是不同浓度CTS对XRS107代谢过程代谢中速率常数k、最大产热功率Pm和总产热量Q的对比结果。可以看出，在实验浓度范围内，CTS的加入对代谢常数、最大产热功率和总产热量没有明显影响。与对照组总产热量相比，尽管浓度为0 ～0.090 2 g/L的CTS的加入会使得XRS107代谢数据略有变化，但其数值变化不明显，表明CTS虽然参与了XRS107代谢过程，但其影响基本可以忽略不计。

表3　XRS107在不同浓度CTS作用下的对照结果

表4是XRS107在Cu2+作用下的对比结果，表4的结果表明，虽然Cu2+参与了XRS107的代谢过程，但对代谢过程无明显影响。

3结论

本文采用壳聚糖为原料制备了CTS-Cu配合物，并采用微量热法和光密度值法联合研究了CTS-Cu对XRS107代谢的影响。研究结果表明，CTS-Cu对XRS107的生长代谢过程产生明显的影响，其影响特点是低浓度刺激，高浓度抑制，而CTS和Cu2+对XRS107的生长过程无明显影响。

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Microcalorimetric Study on Interaction of Chitosan

Copper and Endophyte of Walnut in Walnuton

Hu Fan, Luo Xiaojie, Liu Yuqing, Lu Yao, Xia Caifeng*

(SchoolofChemistryandMaterialsScience,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

Key Words：chitosan-Cu(CTS-Cu);walnut endophyte(XRS107);infrared spectroscopy;microcalorimetry

(责任编辑：张凯兵)